急性髓系白血病（AML）是一种高度侵袭性的血液系统恶性肿瘤，当前治疗主要依赖化疗、放疗及造血干细胞移植等手段，但化疗耐药性仍是影响疗效和预后的关键障碍。近年来研究表明，转录因子FOXO3A在AML细胞增殖和耐药机制中具有关键调控作用，靶向FOXO3A的治疗策略显示出显著前景。然而，由于缺乏高效、特异的FOXO3A抑制剂，其临床应用仍面临瓶颈。因此，亟需探索针对FOXO3A的新型抑制剂及联合治疗方案，以突破耐药瓶颈并优化AML治疗效果。

FOXO3A通过其转录靶标GNG7反向抑制mTOR 

为深入解析FOXO3A调控mTOR活性的分子机制，我们分析了AML细胞中FOXO3A缺失对mTOR表达的影响。结果显示，sgFOXO3A细胞与对照组的mTOR mRNA及蛋白水平无显著差异（图2E），提示FOXO3A调控mTOR磷酸化而非其总蛋白表达。已知mTOR调控因子（如TSC1、Sestrin3、Rictor）是FOXOs的转录靶标，但FOXO3A缺陷细胞中上述基因表达未明显改变。通过整合差异基因（RNA-seq数据）与mTOR上游调控因子（如小GTP酶、激酶、GPCR、生长因子），我们筛选出新型调控因子G蛋白γ亚基7（GNG7）（图1、4A）。GNG7是异源三聚体G蛋白亚基，广泛表达但常在癌症中下调，其通过结合磷脂酶、GRK等效应分子参与信号转导。研究显示GNG7与mTOR活性相关，但机制未明。  

免疫共沉淀实验证实GNG7与mTOR存在相互作用（图4B），原位邻近连接实验（PLA）进一步验证二者直接结合（图4C），表明GNG7通过直接互作抑制mTOR激活。敲除GNG7后，AML细胞中p-mTOR、p-c-JUN及总c-JUN水平显著升高（图4D），流式检测显示GNG7缺陷细胞p-mTOR荧光强度增强（图4E），证实GNG7抑制mTOR磷酸化激活。  

FOXO3A缺失导致GNG7 mRNA及蛋白表达下调（图4F,G），提示GNG7是FOXO3A调控mTOR的潜在介质。CUT&Tag数据显示FOXO3A结合于GNG7启动子区（图4H）。通过预测GNG7启动子区FOXO3A结合基序（GTAAACAA），鉴定出4个潜在位点（图4I）。ChIP-qPCR证实FOXO3A直接结合位点3（图4J）。荧光素酶报告实验显示，野生型结合位点可响应FOXO3A表达上调活性，而突变位点无此效应（图4K,L），表明FOXO3A直接结合GNG7启动子并诱导其表达。在FOXO3A缺陷细胞中过表达GNG7可逆转mTOR与c-JUN的异常激活（图4M），并增强FOXO3A缺失对AML细胞集落形成的抑制（图4N）。综上，FOXO3A通过转录靶标GNG7反向抑制mTOR活性。  

图4. FOXO3A通过转录靶标GNG7反向抑制mTOR 

(A) 整合分析鉴定FOXO3A调控mTOR活性的靶基因（DEGs：FOXO3A缺失后差异表达基因；mTOR调控因子：已报道的mTOR上游调控基因）。  

(B) U-937细胞免疫共沉淀蛋白Western blot（n=3；WCL：全细胞裂解液）。  

(C) 原位连接实验检测U-937细胞中GNG7/mTOR相互作用（阴性对照：抗GNG7抗体与IgG；细胞核DAPI染色，标尺=10 μm）。  

(D) Western blot检测转导指定慢病毒的白血病细胞中蛋白表达（n=3）。  

(E) 流式细胞术分析白血病细胞p-mTOR水平，柱状图显示MFI（n=3-4）。  

(F) 白血病细胞中GNG7 mRNA相对表达量（n=4）。  

(G) Western blot检测白血病细胞中GNG7蛋白水平（n=3）。  

(H) FOXO3A CUT&Tag信号在GNG7基因位点附近的分布。  

(I) 预测的GNG7启动子上游FOXO3A结合位点（黑色区域）。  

(J) ChIP-qPCR检测FOXO3A在GNG7启动子区的结合（n=4；IgG为阴性对照，富集度以input为基准）。  

(K) 野生型与突变型GNG7启动子-荧光素酶报告载体构建示意图。  

(L) 293T细胞转染野生型/突变型GNG7启动子报告载体及pLV/pLV-FOXO3A后的荧光素酶活性分析（n=5）。  

(M) Western blot检测对照组与FOXO3A缺陷THP-1细胞（过表达或不表达GNG7）中蛋白水平（n=3）。  

(N) 集落形成实验：对照组与FOXO3A缺陷白血病细胞（过表达或不表达GNG7）接种5000个细胞后6-7天集落计数（n=3）。误差线表示均值±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s.无显著性差异（t检验或单因素方差分析）。 

基于结构的虚拟筛选鉴定栀子苷为FOXO3A抑制剂 

为筛选FOXO3A抑制剂，我们基于其DNA结合域（DBD，PDB id 2UZK）对“已批准药物库”（L1000）及“天然化合物库”（L6020）进行虚拟筛选（图5A,B）。针对FOXO3A DBD螺旋3（DNA识别关键区域）筛选出前5位候选化合物（图5B-D）。功能验证发现，栀子苷（Gardenoside）等3种化合物可显著抑制FOXO3A靶基因（GNG7/CDKN2D）表达（图5E）。荧光素酶报告实验显示，栀子苷抑制FOXO3A-DNA结合的IC50为7.1 μM，优于其他候选分子（图5F）。分子对接模型表明，栀子苷通过氢键与DCB10、DAB9等残基结合，占据螺旋3口袋（图S4C）。CUT&Tag及ChIP-qPCR证实，栀子苷处理显著减少FOXO3A在靶基因启动子区的结合（图5G-I），且不影响其蛋白水平（图S4D）。栀子苷可诱导AML细胞基因表达谱改变（与FOXO3A缺失表型一致），并下调GNG7表达，激活mTOR信号（图5J-L），提示其通过抑制FOXO3A功能发挥作用。  

图5. 基于结构的虚拟筛选鉴定FOXO3A抑制剂  

(A) 从“已批准药物库”（L1000）和“天然化合物库”（L6020）筛选FOXO3A抑制剂的流程图。  

(B) 基于FOXO3A DNA结合结构域（DBD）晶体结构的分子对接模型，红色区域为螺旋3结合口袋。  

(C) 前5位候选化合物的二维结构。  

(D) 候选化合物在FOXO3A螺旋3口袋的结合模型。  

(E) U-937细胞经溶剂或指定化合物（5 μM）处理24小时后GNG7与CDKN2D mRNA相对表达量。  

(F) 荧光素酶活性分析检测3种候选化合物对FOXO3A DNA结合的体外抑制作用（293T细胞转染野生型GNG7启动子报告载体及pLV-FOXO3A）。  

(G) 对照组与FOXO3A缺陷THP-1细胞（经栀子苷5 μM处理或不处理）全基因组FOXO3A CUT&Tag信号在基因附近的分布热图（TSS：转录起始位点；TES：转录终止位点）。  

(H) 全基因组FOXO3A CUT&Tag峰在TSS和TES区域（±3000 bp）的平均分布图。  

(I) ChIP-qPCR检测U-937细胞中FOXO3A在指定基因启动子区的结合（n=4；IgG为阴性对照）。  

(J) U-937细胞经溶剂或栀子苷（5 μM）处理48小时后指定基因mRNA相对表达量（n=3）。  

(K,L) 流式细胞术检测U-937细胞p-mTOR水平，柱状图显示MFI（n=3-4）。误差线表示均值±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s.无显著性差异（t检验或单因素方差分析）。 

栀子苷联合雷帕霉素延缓AML体内进展  

栀子苷单药可剂量依赖性抑制AML细胞增殖，联合雷帕霉素后协同效应显著（图6A-C）。集落形成实验显示，联合治疗组集落数最少（图6D），凋亡比例显著增加。对3例AML患者原代细胞的研究表明，联合治疗显著抑制细胞增殖（图6E）并减小集落体积（图6F）。  

在PDX模型中，栀子苷（15 mg/kg）或雷帕霉素（4 mg/kg）单药均降低外周血白血病负荷，联合治疗组效果最佳（图6H,I），中位生存期延长至88天（图6J）。安全性评估显示，C57BL/6J小鼠接受4周联合治疗后未出现体重下降或器官损伤（图6L,M），骨髓有核细胞、造血祖细胞（HPC/LSK）及HSC数量变化轻微，仅长期HSC（SLAM HSC）数量略有减少（图6N-R）。综上，栀子苷联合雷帕霉素可安全有效延缓AML进展，为临床治疗提供新策略。

图6. 栀子苷联合雷帕霉素延缓AML体内进展  

(A-C) CCK8法检测白血病细胞体外活力，经溶剂、雷帕霉素（100 nM）及不同浓度栀子苷处理48小时（n=4）。  

(D) 集落形成实验：白血病细胞经指定抑制剂（雷帕霉素100 nM、栀子苷5 μM、联合治疗）处理后的集落计数（接种5000个细胞后6-7天，n=3）。  

(E) CCK8法检测AML患者骨髓原代白血病细胞经指定抑制剂处理48小时后的体外增殖能力。  

(F) 患者3骨髓白血病细胞集落形态（标尺=100 μm）。  

(G) 患者来源异种移植（PDX）模型实验设计：患者3骨髓白血病细胞移植至NOD/SCID小鼠，移植10天后接受溶剂、栀子苷（15 mg/kg，腹腔注射，每周3次）、雷帕霉素（4 mg/kg）或联合治疗三周。  

(H,I) 流式细胞术检测治疗结束时受体小鼠外周血中hCD45+白血病细胞比例（n=5）。  

(J) 不同治疗组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（每组n=5）。  

(K) 抑制剂治疗实验设计：野生型C57BL/6J小鼠接受溶剂或栀子苷（15 mg/kg）联合雷帕霉素（4 mg/kg）治疗4周。  

(L,M) 治疗结束时小鼠体重及器官重量分析（n=5）。  

(N) 治疗结束时小鼠骨髓有核细胞计数（n=5）。  

(O,P) 治疗结束时小鼠骨髓中造血祖细胞（HPC）及LSK细胞计数（n=5）。  

(Q) 流式细胞术分析治疗结束时小鼠骨髓HSC（CD34+LSK或CD48−CD150+LSK）比例。  

(R) 治疗结束时小鼠骨髓CD34+LSK及SLAM HSC（CD48−CD150+LSK）细胞计数。误差线表示均值±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s.无显著性差异（t检验、单因素方差分析或Mantel-Cox检验）。

讨论

FOXO3A在造血与白血病发生中具有关键作用，其缺失可诱导AML细胞凋亡与髓系分化成熟。本研究进一步揭示了FOXO3A维持AML细胞的分子机制及其抑制后引发的分子再激活现象。我们发现FOXO3A通过转录激活GNG7的表达抑制mTOR信号通路，而GNG7直接与mTOR相互作用并抑制其磷酸化激活。基于此，联合抑制FOXO3A与mTOR可对AML细胞产生协同细胞毒性效应，并延长AML小鼠模型的生存期。此外，我们鉴定出具有抗白血病活性的FOXO3A抑制剂栀子苷，其与雷帕霉素联用为AML治疗提供了新策略。

AML的干预策略建立在对分子调控网络的深入认知之上。尽管MLL、Myc、NOTCH、β-连环蛋白等基因已被证实对AML细胞增殖与分化至关重要，但维持AML细胞的分子网络仍不甚明晰。研究表明，FOXO3A亦是AML进展的关键因子：其高磷酸化水平及高表达是AML不良预后标志；FOXO3A维持AML细胞未成熟状态，并驱动MLL-AF9诱导白血病的进展；组蛋白甲基转移酶MLL4通过调控FOXO3A依赖性基因抑制髓系分化。小鼠LSK细胞中FoxO1/3/4缺失导致78个基因表达异常，而MLL4缺陷的MLL-AF9白血病细胞中外源FoxO3a可逆转FoxOs调控基因（如TSC22d3、Tek等）的表达。然而，上述基因是否为FOXO3A直接靶标尚缺乏ChIP及拯救实验证据。本研究通过整合RNA-seq、CUT&Tag-seq及ChIP-PCR技术，鉴定了NOTCH3、CDKN2D、DNTT、CD70、GNG7等FOXO3A直接靶标。其中，FOXO3A促进促白血病基因NOTCH3转录，同时抑制细胞周期抑制因子CDKN2D的表达。敲低CDKN2D可部分恢复FOXO3A缺陷细胞的集落形成能力，证实FOXO3A通过多靶标协同维持AML细胞。

mTOR作为进化保守的激酶，在AML患者中常过度激活。抑制mTOR（如雷帕霉素）可通过阻滞增殖、诱导凋亡发挥抗白血病作用，但过度激活的mTOR信号亦会促使白血病干细胞（LSC）退出静息状态并削弱其自我更新能力，提示mTOR在白血病中的双重角色。mTORC2通过磷酸化Akt间接抑制FOXO3A活性，而FOXO3A在FL5.12造血细胞中通过靶基因TSC1抑制mTOR信号，提示二者存在互作调控。本研究发现FOXO3A通过诱导GNG7表达抑制mTOR磷酸化激活，而mTOR与FOXO3A的相互制约可能导致单靶点抑制疗效有限。研究证实，联合抑制策略（如肺癌中KRAS/FGFR1双抑制、神经母细胞瘤中抗GD2/CD47联用、AML中NOTCH/FLT3协同抑制）在多种癌症中展现出优势。本研究表明，FOXO3A与mTOR联合抑制可高效清除AML细胞并延缓体内进展，疗效优于单药治疗，但更优药物组合仍需进一步筛选。

靶向转录因子是抗癌治疗的重要策略，但因其作用机制复杂，抑制剂开发面临挑战。例如：小分子NSC59984通过泛素-蛋白酶体途径降解突变p53；Artepillin C破坏CREB/CRTC2转录复合物抑制肝糖异生；Siomycin A抑制FOXOM1转录活性诱导AML细胞凋亡。本研究通过基于结构的虚拟筛选，鉴定出天然化合物栀子苷（Gardenia果实提取物）作为FOXO3A潜在抑制剂。栀子苷通过抑制FOXO3A-DNA结合干扰其对靶基因（CDKN2D、NOTCH3、GNG7）的调控，显著抑制AML细胞活性。已有报道显示，栀子苷可通过CTCF/DPP4信号抑制肝细胞焦亡，并调控大鼠P2X3/P2X7受体表达。尽管栀子苷联合雷帕霉素可有效延缓AML进展并延长生存期，但其是否调控其他靶点及在白血病细胞中的具体作用机制仍需深入探索。此外，栀子苷对FOXO3A转录活性的抑制效能中等（IC50=7.1 μM），未来需进一步优化其生物利用度与疗效。

综上，本研究揭示了AML细胞中mTOR对FOXO3A抑制的适应性激活机制，证实联合抑制策略可增强治疗效果，并鉴定出具有转化潜力的FOXO3A抑制剂，为AML治疗提供了新思路。

文章来源：

Zhe Chen, Qian Guo, Shichen Huang, et al.Overcoming adaptive resistance in AML by synergistically targeting FOXO3A-GNG7-mTOR axis with FOXO3A inhibitor Gardenoside and rapamycin. Genes Dis. 2023 Jan 25;11(1):397-412.

 doi: 10.1016/j.gendis.2023.01.002. eCollection 2024 Jan.