急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性血液恶性肿瘤，其特征是髓系祖细胞异常增殖与分化受阻。越来越多的证据表明，AML细胞受多级调控网络（包括细胞周期调控因子、转录因子、激酶相关因子、表观遗传因子、细胞因子及微环境细胞）的维持。这些细胞内与微环境因子协同加速AML进展并引发化疗耐药，导致AML患者预后不良。因此，阐明维持白血病细胞的分子网络将深化对AML的认识并有助于治疗干预。

来自重庆医科大学的Yu Hou教授团队联合第三军医大学的Jieping Chen/ Shuangnian Xu教授团队在本刊发表了题为“Overcoming adaptive resistance in AML by synergistically targeting FOXO3A-GNG7-mTOR axis with FOXO3A inhibitor Gardenoside and rapamycin”的研究论文，文章研究了FOXO3A在AML中的重要作用，揭示了其在维持白血病细胞活性和调控细胞凋亡与分化中的关键机制。

叉头框蛋白O3（FOXO3，又称FOXO3A）属于进化保守的叉头框转录因子家族。FOXO3A含有负责DNA结合及基因调控的叉头翼状螺旋-转角-螺旋结构域（FKH），参与调控增殖、分化、凋亡与自噬等多个生物学过程。重要的是，FOXO3A在白血病转化与进展中起关键作用。与粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）相比，FOXO3A在白血病粒细胞-巨噬细胞祖细胞（L-GMP）中高表达。FOXO3A高表达是AML的不良预后标志。研究表明，FOXO3A能保护MLL-AF9白血病细胞免受DNA损伤并抑制髓系分化，而其缺失可诱导髓系分化并减弱AML细胞扩增。尽管抑制FOXO3A治疗AML具有潜力，但针对FOXO3A的药理学抑制仍缺乏有效抑制剂。

尽管学界已投入大量精力鉴定白血病中的关键癌蛋白，但单药靶向治疗毒性有限，且获得性耐药进一步限制了疗效。因此，药物联用显示出治疗白血病的潜力，有望克服耐药性、增强细胞毒性效应并扩大治疗范围。例如，协同抑制Bcl2与Bruton酪氨酸激酶可消除弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的增殖；III期试验表明，在DLBCL亚群中，伊布替尼联合R-CHOP化疗优于单药治疗。FLT3内部串联重复（FLT-ITD）是AML常见突变，与单用FLT酪氨酸激酶抑制剂（TKI）相比，多种联合疗法（如Notch抑制剂/TKI、β-连环蛋白抑制剂/TKI、维甲酸/TKI联用）对AML表现出显著杀伤效果。既往研究显示，FOXO3A缺失会反向激活JNK/c-JUN信号，削弱其对AML细胞的细胞毒性效应，提示联合策略可能增强AML细胞对FOXO3A抑制的应答。本研究证实，FOXO3A缺失虽可触发AML细胞凋亡与分化，但同时诱导mTOR信号激活。药理学抑制mTOR与FOXO3A缺失协同诱导AML细胞死亡。进一步研究发现，FOXO3A转录调控多个AML进展相关基因，并证实靶基因GNG7通过GNG7/mTOR相互作用介导FOXO3A对mTOR的抑制作用。此外，我们筛选出小分子化合物栀子苷，其通过与FOXO3A蛋白螺旋结构域结合抑制其功能。与单药治疗相比，栀子苷与雷帕霉素（mTOR抑制剂）联用显著延缓AML进展，为AML治疗提供了联合策略。

FOXO3A缺陷诱导AML细胞髓系分化成熟与凋亡  

FOXO3A高表达已被证实是AML的不良预后因素。本研究通过分析TCGA的AML患者队列发现，FOXO3A表达升高与患者总体生存期缩短显著相关（图1A）。鉴于FOXOs在小鼠AML细胞中具有活性，为探究FOXO3A在人类AML细胞中的作用，我们进一步分析了已发表的单细胞RNA测序（RNA-seq）数据（来自5名健康供体和16例AML患者）。结果显示，原始AML细胞（HSC样、GMP样及ProMono样恶性细胞）中FOXO3A表达水平显著高于健康供体对应细胞（图1B）。  

为明确FOXO3A缺陷对AML细胞的影响，我们利用两种独立的小向导RNA（sgRNAs）构建了FOXO3A敲除（KO）细胞。研究发现，FOXO3A缺失显著抑制了携带MLL-AF9易位的AML细胞系（THP-1和HL-60）及无MLL易位的U-937细胞系的增殖（图1C-E）。Annexin V/PI染色显示，FOXO3A缺陷可诱导AML细胞凋亡（图1F、G）。此外，髓系分化标志物CD11b在FOXO3A缺陷细胞中表达上调（图1H），提示FOXO3A抑制髓系分化。  

图1. FOXO3A对白血病细胞维持至关重要  

(A) TCGA队列中FOXO3A高表达（FOXO3Ahigh）与低表达（FOXO3Alow）AML患者的总生存期Kaplan-Meier曲线。  

(B) 单细胞RNA-seq数据展示健康供体与AML患者骨髓细胞中FOXO3A表达水平（每个点代表一个细胞）。HSC：造血干细胞；Prog：祖细胞；GMP：粒-巨噬细胞祖细胞；Promono：前单核细胞；Mono：单核细胞（数据来自GSE116256）。  

(C-E) 白血病细胞转导指定慢病毒后的生长曲线（n=4）。  

(F,G) 流式细胞术检测Annexin V/PI染色显示白血病细胞凋亡比例（柱状图表示Annexin V阳性细胞百分比，n=3-4）。 

(H) 流式细胞术检测白血病细胞CD11b表达强度（n=3）。  

(I) U-937细胞转导指定慢病毒后差异表达基因（上调或下调≥2倍）火山图（n=3）。  

(J) FOXO3A缺陷白血病细胞差异基因KEGG通路富集分析。  

(K) 细胞周期相关基因表达热图（n=3，数据来自RNA-seq）。  

(L) 基因集富集分析（GSEA）显示FOXO3A缺陷白血病细胞中凋亡相关基因集富集（数据来自RNA-seq）。  

(M) U-937细胞全基因组FOXO3A CUT&Tag信号在基因附近的分布热图（TSS：转录起始位点；TES：转录终止位点）。  

(N) 全基因组FOXO3A CUT&Tag峰在TSS和TES区域（±3000 bp）的平均分布图。  

(O) 整合分析鉴定白血病细胞中FOXO3A潜在靶基因（DEGs：FOXO3A缺失后表达显著变化基因，FPKM>1且倍数变化>2；CUT&Tag：FOXO3A结合显著富集基因，RPKM>1。红色为FOXO3A潜在正调控靶标，蓝色为潜在负调控靶标）。  

(P) 对照组与FOXO3A缺陷白血病细胞（联合或不联合CDKN2D敲低）的集落形成实验（接种5000个细胞后6-7天计数，n=3）。误差线表示均值±标准差；∗P<0.05，∗∗P<0.01，∗∗∗P<0.001；n.s.无显著性差异（单因素方差分析）。

FOXO3A通过CDKN2D部分维持AML细胞增殖  

作为转录因子，FOXO3A的基因调控具有细胞类型依赖性，其在AML细胞中的确切靶标尚未明确。为探究FOXO3A调控AML细胞功能的分子机制，我们通过RNA-seq分析发现，与对照细胞相比，FOXO3A缺陷的U-937细胞中有327个基因显著上调，202个基因显著下调（变化倍数>2，P<0.01；图1I）。差异基因主要富集于造血细胞谱系、Wnt信号、mTOR信号、FOXO信号、凋亡、NOTCH信号及细胞周期等通路（图1J）。值得注意的是，多个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂编码基因（如CDKN2A、CDKN2B、CDKN2D）表达上调，而细胞周期蛋白或细胞周期依赖性激酶编码基因（如CCNB1、CCNB2、CCNB3、CDK2）表达下调（图1K），提示FOXO3A缺陷在分子水平抑制AML细胞周期进程。基因集富集分析（GSEA）进一步显示，FOXO3A缺陷细胞中上调基因富集于凋亡与细胞因子受体相互作用通路，下调基因则富集于NOTCH及Wnt/β-catenin信号通路（图1L）。  

为鉴定FOXO3A直接靶标，我们利用CUT&Tag技术绘制了U-937细胞全基因组FOXO3A结合位点图谱。FOXO3A缺陷细胞的CUT&Tag数据无显著峰信号，而对照细胞数据显示FOXO3A主要结合于基因转录起始位点（TSS）区域（图1M,N），证实其转录调控特异性。通过整合RNA-seq与CUT&Tag数据，我们鉴定出38个FOXO3A直接调控基因，包括其正调控基因（如DNTT、NOTCH3、GNG7）及负调控基因（如CDKN2D、ZNF254、GPR18）（图1O及表S2）。染色质免疫沉淀PCR（ChIP-PCR）验证了FOXO3A在NOTCH3、CDKN2D、CD70及DNTT启动子区的结合，qRT-PCR结果亦与RNA-seq数据一致。此外，FOXO3A在这些靶基因TSS或TES区域的结合峰与RNA-seq信号变化相关。已知NOTCH3促进AML转化与进展，而CDKN2D是白血病生长抑制因子。为验证FOXO3A是否通过抑制CDKN2D维持AML细胞扩增，我们利用两种短发夹RNA（shRNA）敲低CDKN2D表达。结果显示，CDKN2D敲低可部分恢复FOXO3A缺陷细胞的集落形成能力（图1P），表明FOXO3A通过抑制CDKN2D部分维持AML细胞增殖。  

FOXO3A缺失导致AML细胞mTOR活性升高  

既往研究表明，FOXO3A缺陷通过反向激活JNK/c-JUN信号削弱其对AML细胞的细胞毒性效应，提示AML细胞对FOXO3A抑制存在适应性耐药。本研究发现，FOXO3A缺陷细胞中上调基因富集于PI3K-Akt与mTORC1通路相关基因（图2A）。已知约60%的AML患者存在mTOR过度激活，且mTOR对白血病细胞增殖生存至关重要。通过磷酸化流式分析，我们发现FOXO3A缺陷细胞中磷酸化mTOR（p-mTOR）及下游磷酸化S6（p-S6）水平显著升高（图2B-D）。Western blot结果进一步证实FOXO3A缺失导致p-mTOR、p-S6、p-JNK及p-c-JUN蛋白水平上调（图2E）。mTOR信号通过调控线粒体代谢影响白血病细胞生长与成熟。线粒体DNA定量显示FOXO3A缺陷细胞线粒体数量及ATP生成增加，DCFH-DA检测发现其活性氧（ROS）水平升高，提示FOXO3A缺陷增强线粒体代谢。  

雷帕霉素处理可逆转FOXO3A缺陷细胞线粒体数量与ATP生成的增加。鉴于线粒体代谢产生的ROS可激活JNK/c-JUN信号，我们推测FOXO3A抑制通过mTOR-ROS轴激活JNK/c-JUN。添加雷帕霉素或ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，FOXO3A缺陷细胞的ROS水平及p-JNK、p-c-JUN蛋白水平显著降低，证实该机制。  

图2. FOXO3A缺陷激活mTOR信号  

(A) GSEA富集图显示FOXO3A缺陷白血病细胞中基因集的富集情况（数据来自RNA-seq）。  

(B-D) 流式细胞术检测转导指定慢病毒的白血病细胞中p-mTOR及p-S6水平，柱状图显示p-mTOR与p-S6的平均荧光强度（MFI，n=3-4）。  

(E) Western blot检测白血病细胞中指定蛋白表达水平（n=3）。  

(F-H) CCK8法检测白血病细胞体外活力，经不同浓度雷帕霉素处理48小时（n=3）。  

(I-L) Annexin V/PI染色流式分析白血病细胞凋亡，经雷帕霉素（100 nM）或SP600125（5 μM）处理48小时，柱状图显示Annexin V阳性细胞百分比（n=3-5）。  

(M) 瑞氏-吉姆萨染色显示U-937细胞经指定药物处理后的形态学变化（标尺=10 μm）。误差线表示均值±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s.无显著性差异（单因素方差分析）。  

mTOR与FOXO3A联合抑制在体内显示抗AML疗效

为评估FOXO3A与mTOR联合抑制的体内疗效，NOD/SCID小鼠移植U-937 AML细胞后接受雷帕霉素（4 mg/kg，腹腔注射，每周3次）或SP600125（15 mg/kg，腹腔注射，每周3次）治疗（图3A）。hCD45检测显示，FOXO3A缺陷联合雷帕霉素或SP600125显著降低外周血白血病负荷（图3B,C），其中雷帕霉素组脾肿大最轻且脾脏/骨髓hCD45浸润最少（图3C,D）。生存分析表明，雷帕霉素治疗组小鼠生存期显著延长（图3E）。  

在MLL-AF9诱导的AML小鼠模型中，联合抑制FoxO3a与mTOR可减轻脾肿大（图3G,H），并显著降低外周血、脾脏及骨髓中白血病细胞比例。接受MLL-AF9转导的FoxO3a缺陷HSPCs的小鼠白血病进展延缓，而雷帕霉素或SP600125治疗进一步延长生存期（图3I）。综上，FOXO3A与mTOR联合抑制可有效延缓AML体内进展。

图3. mTOR与FOXO3A联合抑制在体内抑制AML进展

(A) AML细胞系来源异种移植实验设计。移植10天后，NOD/SCID小鼠接受溶剂（Ve）、雷帕霉素（Ra，4 mg/kg，腹腔注射，每周3次）、SP600125（SP，15 mg/kg，腹腔注射，每周3次）或联合治疗（Ra+SP）三周。  

(B,C) 流式细胞术检测治疗结束时受体小鼠外周血（PB）、脾脏及骨髓（BM）中人CD45阳性白血病细胞比例，柱状图显示PB中hCD45+细胞百分比（n=5-7）。  

(D) 治疗结束时受体小鼠脾脏重量分析（n=5）。  

(E) 不同治疗组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（每组n=6）。  

(F) 小鼠MLL-AF9白血病模型实验设计。二次移植后，受体小鼠接受溶剂、雷帕霉素（4 mg/kg）、SP600125（15 mg/kg）或联合治疗三周。  

(G) 治疗结束时受体小鼠脾脏形态。  

(H) 治疗结束时脾脏重量分析（n=5）。  

(I) 不同治疗组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（每组n=6）。误差线表示均值±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（单因素方差分析或Mantel-Cox检验）。  

文章来源：

Zhe Chen, Qian Guo, Shichen Huang, et al.Overcoming adaptive resistance in AML by synergistically targeting FOXO3A-GNG7-mTOR axis with FOXO3A inhibitor Gardenoside and rapamycin. Genes Dis. 2023 Jan 25;11(1):397-412. doi: 10.1016/j.gendis.2023.01.002. eCollection 2024 Jan.