类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种慢性、炎症性和自身免疫性疾病。其主要病理特征是受累关节炎症和骨破坏，如果在早期得不到及时治疗，将导致关节不可逆或永久性的破坏。破骨细胞的分化和活化加速骨吸收，导致骨侵蚀，可见破骨细胞是导致骨吸收的关键细胞，也成为药物防治和控制RA骨破坏的重要靶细胞。目前现代医学治疗RA的药物主要包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗风湿药物以及新型的生物制剂等，虽然西药治疗能一定程度减轻RA症状，但治疗费用昂贵、不良反应较多，限制了其广泛应用。

中医药在改善RA关节功能、延缓骨破坏等方面具有独特的优势。草乌甲素（bulleyaconitineA）是从乌头属植物滇西嘟拉中提取出的二萜双酯型生物碱——滇西嘟拉碱甲，具有良好的抗炎、镇痛及免疫调节作用，草乌甲素注射液及草乌甲素片已批准用于慢性疼痛和RA的治疗。此外，有研究表明草乌甲素可抑制破骨细胞分化及其介导的骨吸收过程，但草乌甲素在RA骨破坏中的作用机制尚不明确。为进一步阐明草乌甲素改善RA骨破坏的作用机制，本研究基于网络药理学方法筛选草乌甲素改善RA骨破坏的潜在作用机制，结合体外实验对其可能作用机制进行验证，揭示草乌甲素对RA骨破坏的药理作用，并确定其作用机制，为临床应用提供相关实验依据。

1.材料

1.1.仪器MK3型全自动酶标仪、VeritiPro型PCR扩增仪（美国Thermo公司）；CKX41型倒置显微镜、CKX31型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；MiniTrans-Blot®Cell型转移电泳槽、Basic型PowerpacTM电泳仪（美国Bio-Rad公司）；FusionFX型凝胶成像仪（法国Vilber公司）。1.2.药物与试剂草乌甲素（货号B20133，纯度98%，上海源叶生物科技有限公司）；巨噬细胞刺激因子（macrophage-colonystimulatingfactor，M-CSF）、NF-κB配体受体激活物（receptoractivatorofnuclearfactor-κB，RANKL）（货号分别为315-02、315-11，美国Peprotech公司）；“-MEM培养基（货号8123466，美国Gibco公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH，货号ab181602，美国Abcam公司）；磷酸化非受体酪氨酸激酶（phosphorylatedcell-sarcomareceptorcoactivatorTyr419，p-c-Src，货号YP0077，美国Immunoway公司）；磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗体、蛋白激酶B抗体（proteinkinaseB，Akt）（货号分别为C73F8、Ser473、C67E7，美国CellSignalingTechnology公司）。

2.方法

2.1.草乌甲素潜在靶点筛选

在PubChem找到草乌甲素的CanonicalSMILES，把SMILES代入SwissTargetPrediction数据库进行预测靶点，筛选probability＞0的靶点。同时在PubChem下载草乌甲素的2DStructure的SDF格式，导入PharmMapper数据库，筛选得到潜在靶点。将2个数据库预测的靶点进行汇总、删除重复值，得到草乌甲素潜在靶点。

2.2.RA骨破坏关键靶点的获取以“rheumatoidarthritisbonedestruction”为关键词，检索GeneCards、PharmGKB和OMIM数据库获取RA骨破坏的主要靶点，根据相关性将3个数据库中的靶点信息进行筛选，删除重复值，导入UniProt数据库获得标准化的靶基因信息。

2.3.草乌甲素与RA骨破坏作用靶点预测与PPI网络构建

通过Venny2.1.0平台获取草乌甲素与RA骨破坏的交集靶点，利用微生信网站绘制韦恩图。将交集靶基因导入STRING网站（https://string-db.org/），选择物种为人（Homosapiens），设置靶点间最低联系分数≥0.4，进行蛋白互作（protein-proteininteraction，PPI）网络构建，保存网络图及TSV格式分析结果。运用Cytoscape3.8.0软件及其插件CytoNCA对PPI网络进行拓扑分析，计算网络中各节点的平均最短路径（averageshortestpathlength）介数中心性（betweennesscentrality）、中心接近度（closenesscentrality）、度值（degree），根据度值排序，筛选出草乌甲素改善RA骨破坏的核心靶点。

2.4.草乌甲素抗RA骨破坏关键靶点的GO和KEGG富集分析将草乌甲素抗RA骨破坏的前10个关键靶点导入到DAVID数据库，设置物种为“Homosapiens”，进行基因功能注释（GeneOntology，GO）和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）富集分析。选择生物过程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和细胞组分（cellularcomponent，CC）对草乌甲素抗RA骨破坏的关键靶点进行GO富集分析。以P对GO过程及KEGG通路进行功能排序，分别选取前 10、20位用微生信网站进行可视化分析，综合预测草乌甲素改善RA的分子作用机制。

2.5.分子对接技术预测草乌甲素与靶点的结合能力

在PubChen下载草乌甲素2D结构的SDF格式，在Chem3D软件中将2D结构优化，转变为最小结核能状态，并保存为mol2格式；在UniProt找到靶点的entry号，根据entry号在PBD数据库下载靶点的pbd格式，将草乌甲素的mol2格式和靶点的pbd格式导入AutoDockTools数据库，输出pdbqt格式。将pdbqt格式导入AutoDockVina软件，检验结合活性，最后通过PyMOL对结果进行可视化。

2.6.小鼠原代骨髓巨噬细胞（bonemarrow-derivedmacrophages，BMMs）的提取和分离将6~8周龄C57BL/6小鼠脱颈处理，75%乙醇浸泡5～10min，无菌分离小鼠双侧后肢股骨和胫骨。乙醇消毒后移入无菌操作台，切开两端骨髓腔，充分暴露骨髓腔，收集骨髓腔细胞悬液，离心后弃上清，加入红细胞裂解液混合，磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗涤，用含10%胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）的“-MEM培养基重悬细胞，计数。

2.7.破骨细胞的诱导及给药将BMMs细胞用含20ng·mL-1M-CSF的完全培养基（“-MEM含10%FBS）稀释后，按需种板，孔板置于5%CO2、37℃的培养箱中。培养72h后用含20ng·mL-1M-CSF和50ng·mL-1RANKL的完全培养基诱导破骨细胞分化，隔天换液，待成熟破骨细胞分化而成。诱导破骨细胞的同时给予草乌甲素干预，即给药时间为诱导时间，分为空白组、RANKL诱导组以及草乌甲素不同剂量给药组（12.5、25、50μmol·L-1），每组3个复孔。草乌甲素的母液用二甲基亚砜溶解，给药时用培养基进行稀释。

2.8.定量实时聚合酶连锁反应（quantitativerealtimepolymerasechainreaction，qRT-PCR）检测破骨细胞分化相关基因表达细胞接种于6孔板，按2.7项下方法诱导破骨细胞。细胞诱导培养的同时给予草乌甲素干预5d后，收集细胞。用TRIzol法提取RNA，对RNA样本进行逆转录，得到cDNA。结合网络药理结果利用软件Primer6.0设计引物，引物序列见表1。以40倍稀释的cDNA为模板，采用设计好的正、反向特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增反应条件：95℃预变性10min；变性95℃15s，延伸1min，共35个循环。用2−ΔΔCt法计算组织蛋白酶K（cathepsinK，CTSK）、基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）相对于GAPDH的mRNA表达量。

2.9.免疫荧光法检测破骨细胞分化体系中核心靶点蛋白表达细胞接种于24孔板，按2.7项下方法诱导破骨细胞。细胞诱导培养的同时给予草乌甲素干预7d后，收集细胞。PBS洗2遍，4%组织固定液固定，PBST打孔15min，加入p-c-Src抗体（1:50）孵育过夜。复温30min，加入荧光二抗，包锡纸避光，37℃水浴锅孵育1h。加入PBS稀释75倍的phalloidin避光孵育100min，加入PBS稀释5000倍的Hoechst避光孵育15min。用防荧光淬灭剂封片，周围加上指甲油防气泡，于双光子共聚焦下拍照。

2.10.蛋白免疫印迹法（WesternBlot）检测破骨细胞分化体系中Src/PI3K/Akt通路关键蛋白表达细胞接种于6孔板，按2.7项下方法诱导破骨细胞。细胞诱导培养的同时给予草乌甲素干预5d后，收集细胞。细胞蛋白样本加入含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30min，4℃,12000r·min-1离心5min取上清即得总蛋白，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，蛋白样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采取湿转法将蛋白转印到PVDF膜上，5%BSA封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温摇床孵育2h，最后加入ECL化学发光检测剂，在凝胶成像仪内曝光。

2.11.数据处理与分析利用ImageJ软件对所采集图像灰度值进行统计处理，采用GraphPadPrism8.0统计软件对所得数据进行统计分析。实验结果以均数±标准差（x±s）表示，P＜0.05认为差异有统计学意义。     

3.结果

3.1.草乌甲素抗RA骨破坏作用靶点预测

在GeneCards、PharmGKB和OMIM数据库获取RA骨破坏的主要靶标基因，根据相关性将3个数据库中的靶基因信息进行筛选，删除重复值，得到1653个主要靶基因。将SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库获取的草乌甲素潜在靶基因进行汇总、删除重复值，得到291个靶基因。将RA骨破坏的主要靶基因和草乌甲素的潜在靶基因进行交集分析，得到29个交集靶基因。

3.2.草乌甲素抗RA骨破坏的PPI网络构建及拓扑分析

上述获得的交集靶基因进行PPI网络构建，删除未与其他蛋白发生互作的游离靶基因后。将交集靶基因进行拓扑分析，度值越大，则该靶点在草乌甲素治疗RA骨破坏中越重要。Src在该网络中占据核心地位，表明Src可能是草乌甲素抗RA骨破坏的关键靶点。PPI网络中度值排名前10位靶点的拓扑分析见中国知网本文增强出版附加材料。

3.3.草乌甲素抗RA骨破坏关键靶点的GO和KEGG富集分析

草乌甲素抗RA骨破坏前10个关键靶点的GO富集分析涉及71个生物过程（BP）、14个细胞成分（CC）和21个分子功能（MF），分别选取前10项进行可视化。GO分析显示草乌甲素治疗RA的靶点主要集中在Akt信号的正向调节、磷脂酰肌醇磷酸化和免疫反应等生物过程；磷脂酰肌醇-3-激酶复合物、胞质和突触等细胞组分；磷脂酰肌醇-3-激酶活性、ATP结合和肾上腺素受体结合等分子功能上。KEGG富集分析共获得44条通路，依据r选取前10条信号通路进行可视化。结果中主要涉及HIF-1、趋化因子、VEGF、FcepsilonRI、B细胞受体、PI3K/Akt等信号通路。结合文献调研结果，Src激活PI3K/Akt信号通路调控RA骨破坏，因此，本研究选择Src/PI3K/Akt信号通路探索草乌甲素抗RA骨破坏的作用。

3.4.草乌甲素与关键靶点的分子对接

根据上述PPI拓扑分析和KEGG富集分析，选择草乌甲素抗RA骨破坏的核心机制Src/PI3K/Akt与草乌甲素进行结合能预测。通常配体与受体结合能越低，结合的构象越稳定。草乌甲素与Src、PIK3CA、AKT1的结合能小于－5.0kcal·mol-1表示有较好的结合活性，且草乌甲素与Src、PIK3CA的结合能小于－7.0kcal·mol-1表示有强烈的结合活性。

3.5.草乌甲素对破骨细胞分化相关基因mRNA表达的影响

qRT-PCR结果表明，与空白组相比，RANKL诱导破骨细胞分化后，细胞中MMP-9和CTSKmRNA的表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，草乌甲素剂量依赖性地抑制MMP-9和CTSKmRNA的表达（P＜0.01）。

3.6.草乌甲素对破骨细胞分化体系中p-c-Src蛋白表达的影响

c-Src蛋白是Src在细胞中广泛表达的非受体型蛋白酪氨酸激酶，在破骨细胞和成骨细胞中发挥重要作用，主要通过磷酸化蛋白酪氨酸激酶的形式参与破骨细胞的分化。通过免疫荧光实验验证破骨细胞分化体系中p-c-Src表达的变化，结果显示，与空白组相比，RANKL诱导的破骨细胞骨架明显增大，p-c-Src在胞浆内表达明显增强；经草乌甲素干预后，与模型组相比，破骨细胞数量减少，体积降低，草乌甲素50μmol·L-1组基本无破骨细胞骨架生成，且p-c-Src在胞浆中的表达随草乌甲素给药剂量的增加呈剂量依赖性降低。

3.7.草乌甲素对破骨细胞分化体系中Src/PI3K/Akt通路关键蛋白表达的影响

为进一步验证草乌甲素对抑制RA骨破坏的作用机制，使用Westernblot检测破骨细胞中Src/PI3K/Akt通路关键蛋白的表达情况。结果显示，与空白组相比，RANKL诱导后p-c-Src、PI3K和p-Akt的蛋白表达均显著上调；与模型组相比，草乌甲素干预后，p-c-Src、PI3K、p-Akt蛋白表达显著降低（P＜0.01），且p-c-Src和p-Akt的蛋白表达随草乌甲素给药剂量的增加呈剂量依赖性降低。

4.讨论

RA是常见的炎症性疾病，病情迁延，致残率高，其发病过程非常复杂，目前尚未被阐明，主要与遗传因素、环境因素、免疫细胞、细胞因子、自身抗体等密切相关。RA发病率的持续增加，给全球医疗保健系统带来了相当大的负担。目前西药治疗RA存在诸多限制，而草乌甲素与非甾体抗炎药、阿片类镇痛药物不同，不易出现胃肠道和心血管及肾脏不良反应、药物依赖等潜在危险，适合慢性疼痛、癌痛、骨关节炎等各种原因所致的慢性疼痛的长期用药，同时其还具有免疫调节作用，治疗RA具有明显的优势。多项临床研究表明，草乌甲素联合其他药物治疗不仅显著降低患者血沉、C反应蛋白和免疫球蛋白，而且能缓解关节疼痛、改善膝骨性关节病变中的骨破坏。研究证明草乌甲素可明显减少关节炎小鼠的骨质流失，减轻关节滑膜损伤和软骨破坏，改善小鼠后肢的骨破坏和关节畸形。上述研究证实了草乌甲素在抑制骨破坏中发挥较为显著的作用，然而，草乌甲素在RA骨破坏中具体的作用机制仍不明确。因此本研究通过网络药理学研究方法筛选草乌甲素抗RA骨破坏的潜在作用机制，建立体外破骨细胞分化模型，观察草乌甲素对RA骨破坏的作用特点，并进行初步机制探索。本研究首先通过网络药理学方法筛选草乌甲素改善RA骨破坏的交集靶基因，运用PPI网络拓扑分析，得到草乌甲素改善RA骨破坏的核心靶点为Src。KEGG富集分析结合文献调研，发现草乌甲素可能通过调控Src/PI3K/Akt信号通路发挥抗RA骨破坏的作用。分子对接结果显示，草乌甲素与Src、PIK3CA和AKT1均有较好的结合能力。

在细胞中的Src基因被称为c-Src，c-Src是骨代谢中的关键信号分子，在调节生长、存活、增殖、黏附和运动中发挥重要作用。c-Src受到严格的调控，在体内处于抑制状态，可通过Y416位点的磷酸化激发c-Src的活性。破骨细胞内活化的c-Src可促进其伪足小体和封闭区域的形成，伪足小体是破骨细胞在趋化信号的刺激下聚集胞内骨架蛋白来形成，它的形成是破骨细胞能够迁徙的首要步骤，最终有利于细胞的迁移；而且活化的c-Src进一步触发下游蛋白信号传导，导致细胞骨架重组和骨吸收活性降低。研究表明活化的c-Src蛋白可激活下游的PI3K蛋白，PI3K通过磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）来完成Akt活化，Akt能释放胞质中的NF-κB，从而调控破骨前体细胞的分化过程。在RA发生发展过程中，PI3K/Akt信号通路也是调节炎症因子产生的经典信号通路，其通过刺激TNF-“、IL-17等细胞因子的产生参与破骨细胞分化，并趋化破骨细胞迁移，破坏骨质与关节软骨，最终导致关节畸形。研究表明五味子素通过抑制PI3K/Akt和NF-κB信号通路，改善了CIA模型小鼠的关节炎症和骨破坏。以上证据提示了调控Src/PI3K/Akt信号通路可能成为草乌甲素改善RA骨破坏的关键机制。因此，本研究通过qRT-PCR实验进行验证，结果显示，草乌甲素剂量依赖性地抑制RANKL诱导破骨细胞中标志性炎症因子MMP-9和CTSKmRNA的表达。通过免疫荧光实验验证破骨细胞分化体系中p-c-Src表达的变化，结果表明，RANKL诱导后胞浆中的p-c-Src显著激活，而p-c-Src在胞浆中的表达随草乌甲素给药剂量的增加呈剂量依赖性降低。通过Westernblot实验进一步验证在草乌甲素的干预下，破骨细胞中Src/PI3K/Akt通路关键蛋白的表达情况，结果显示草乌甲素能够显著降低p-c-Src、PI3K和p-Akt的蛋白表达。以上结果提示草乌甲素可能通过调控Src/PI3K/Akt信号通路来抑制破骨细胞分化，减轻关节的损伤，缓解RA病情。

综上所述，本研究基于网络药理学研究方法筛选出草乌甲素改善RA骨破坏的潜在作用机制，结合体外实验对其可能作用机制进行验证，研究结果表明草乌甲素可能通过调控Src/PI3K/Akt信号通路来抑制破骨细胞分化，从而改善RA骨破坏。相关研究将为草乌甲素改善RA骨破坏提供实验依据，也为其临床应用提供前期支撑。