在造血干细胞研究领域，UM171 因其能显著促进体外人造血干细胞自我更新而备受关注。最新研究表明，UM171 作为一种“分子胶”分子，能够利用 BTB-KELCH 型底物受体 KBTBD4，使 HDAC1/2 与 CRL3 复合物形成不对称组装，并通过这一特殊构象来降解 LSD1–CoREST 共抑制因子复合物。该过程不仅揭示了 UM171 的直接作用靶点——HDAC1/2，也阐明了它如何与内源性辅因子（如六磷酸肌醇）协同增强 E3–新底物（neosubstrate）间的相互作用，从而显著加速 CoREST 及其伴侣蛋白的降解，维系造血干细胞活力。UM171 这一降解机制的阐明，不仅丰富了我们对 CRL3 E3 连接酶家族协同作用的认识，也为今后设计和改进新型小分子降解剂提供了重要思路。

降解剂是能够促进蛋白质泛素化与降解的小分子。这类化合物分为两类：单价分子胶（glues）和双功能蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）。除了更类似药物的特性外，分子胶区别于PROTACs的核心特征在于其能诱导E3泛素连接酶与新底物间的高亲和力相互作用，而对这些蛋白伴侣至少一方无明显结合力。尽管PROTACs的理性设计已取得快速进展，但由于对分子胶的功能先决条件和E3支架偏好性认知不足，其开发进程缓慢。植物激素生长素和茉莉酸是最早被记录的分子胶，它们劫持CRL1复合物（CUL1–RING连接酶）的F-box蛋白底物受体。在人类细胞中，最典型的分子胶包括沙利度胺及其衍生物、芳基磺酰胺类和CDK12抑制剂。值得注意的是，这些合成化合物均劫持CRL4连接酶（CUL4–RING），引发其他泛素连接酶能否被分子胶重编程的疑问。CRL3家族尤其值得关注，作为最大的CRL家族，其包含近200种底物受体。其成员形成组成型同源二聚体，被内源性底物用于协同结合。然而，CRL3是否可被分子胶利用（特别是利用其固有协同性）仍属未知。  

促进造血干细胞扩增的小分子在细胞治疗中具有临床应用价值。UM171由UM729优化而来，后者在造血干细胞扩增表型筛选中表现出最优活性（图1a）。尽管UM171已被广泛应用并进入人体临床试验，其作用机制仍不明确。近期研究显示，UM171可诱导赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1a（LSD1）和CoREST（由RCOR1编码）的降解。CoREST作为支架蛋白，在其两端分别招募LSD1与组蛋白去乙酰化酶HDAC1或其旁系同源物HDAC2，形成核心LSD1–HDAC1/2–CoREST（LHC）共抑制复合物¹⁷。加入UM171后，CoREST和LSD1被CRL3家族成员KBTBD4²快速降解。尽管取得这些进展，UM171的直接靶点与作用机制仍未阐明。

UM171选择性降解HDAC1/2复合物  

揭示UM171的直接作用靶点

为明确UM171的直接结合靶点，首先通过全局蛋白质组学分析UM171处理（1 μM，6小时）对两种敏感细胞系（SET-2和MV4;11）的蛋白表达影响。结果显示，LSD1及其共抑制因子CoREST（RCOR1）和RCOR3是UM171处理后最显著下调的蛋白（图1b、扩展数据图1a及补充数据1-2）。另一CoREST旁系同源物RCOR2未在此类细胞中表达。其他显著下调的蛋白多与LHC复合物相关（如RREB1、GSE1、HMG20B），提示存在广泛的连带降解效应。通过免疫共沉淀-质谱联用（co-IP-MS）筛选LSD1互作蛋白（，我们发现多数下调蛋白与LHC复合物相关（图1b蓝点），但MIER1虽显著下调却未与LSD1共沉淀（图1b红点），表明其可能是UM171–KBTBD4独立于LSD1的新底物——近期研究已支持这一结论。值得注意的是，所有CoREST旁系同源物及MIER1均含ELM2-SANT串联结构域（扩展数据图1c），提示UM171通过靶向该结构域诱导共抑制因子及其复合体成员的降解。

时间依赖性降解特征  

UM171处理的时间进程分析显示，CoREST在用药后迅速降解（图1c），而LSD1的降解虽显著但滞后，这与前期研究一致。LHC复合物的另一可互换核心成员HDAC1/2在早期时间点的降解程度较低（图1b、扩展数据图1d及补充数据4）。然而，利用K-ε-GG肽段富集的泛素化蛋白质组学显示，UM171处理早期即可检测到CoREST、LSD1、HDAC1和HDAC2的泛素化修饰（图1d、扩展数据图1e及补充数据5-6），表明HDAC1/2的降解受限可能与其他调控机制有关。综合数据支持CoREST是UM171–KBTBD4的直接新底物。

ELM2结构域的关键作用  

通过荧光报告系统（图1e），我们构建了CoREST全长（4–485氨基酸）及截短变体与GFP的融合蛋白（含IRES-mCherry对照）。结果显示：  

- 删除N端4–103氨基酸或SANT2结构域（380–485氨基酸）对降解无显著影响  

- 删除4–189氨基酸（含ELM2结构域）则完全阻断UM171诱导的CoREST-GFP降解（图1f及扩展数据图1f）  

- 更大的C端截短体CoREST(4–308)-GFP虽稳定性降低，但仍可被UM171显著下调（扩展数据图1g）  

免疫共沉淀实验证实，CoREST(4–241)-FLAG可与HA-KBTBD4结合，而CoREST(4–189)-FLAG无此能力（图1g）。类似地，MIER1和RCOR2的ELM2结构域也是UM171诱导降解的必要条件（图1h）。上述结果共同表明，ELM2结构域是UM171介导共抑制因子降解的关键元件。

HDAC1/2相互作用的必要性  

所有受测共抑制因子的ELM2-SANT结构域均介导与HDAC1/2的结合（扩展数据图1c）。我们推测HDAC1/2可能参与UM171的作用机制。通过构建MIER1 Trp214丙氨酸突变（W214A，破坏MIER1–HDAC1界面）及对应CoREST(W138A)、RCOR2(W78A)突变体，发现这些突变显著减弱UM171诱导的降解（图1h）。其中CoREST(W138A)仅部分阻断降解，而破坏性更强的Trp→Asp/Glu突变则完全抑制降解（扩展数据图1h）。综上，HDAC1/2与共抑制因子的相互作用是UM171介导降解的核心机制。

图1：UM171诱导的CoREST降解依赖HDAC1/2相互作用  

HDAC1/2介导LHC–KBTBD4复合物形成  

HDAC1/2的功能验证  

为探究LSD1、HDAC1/2在UM171介导CoREST降解中的作用机制，我们构建了内源性CoREST C端融合GFP的K562基因敲入细胞系。UM171处理可快速诱导KBTBD4依赖的CoREST-GFP降解（扩展数据图2a,b）。CRISPR敲除LSD1未逆转UM171的降解效应，表明LSD1并非UM171作用必需（图2a及扩展数据图2c）。相反，敲除HDAC1或HDAC2可部分阻断CoREST-GFP降解（图2b及扩展数据图2d），提示两者功能冗余。由于HDAC1/HDAC2双敲除致死，我们构建了HDAC1缺失且HDAC2携带dTAG降解标签的细胞系，通过dTAG-13诱导HDAC2快速降解（扩展数据图2e-g）。单独处理dTAG-13导致HDAC2清除及CoREST部分失稳（图2c及扩展数据图2g），而预处理dTAG-13可完全阻断UM171诱导的CoREST降解，证实任一HDAC旁系同源物均可介导UM171作用。免疫共沉淀显示，UM171存在时FLAG-KBTBD4可结合HDAC1/2（图2d）。此外，HDAC活性位点抑制剂（SAHA、CI-994、Cpd-60）预处理可阻断CoREST-GFP降解及UM171诱导的KBTBD4与CoREST、HDAC1/2的共沉淀（图2d,e），但UM171不影响重组HDAC1/2酶活性（扩展数据图3a）。综上，HDAC1/2及其活性位点可及性是UM171降解CoREST的关键，而LSD1非必需。

三元复合物形成机制  

通过荧光偏振实验（FP）发现，UM171衍生物JL1仅在KBTBD4、LHC及肌醇六磷酸（InsP6）共存时结合（图2f及扩展数据图3b-d）。InsP6可稳定HDAC1/2与共抑制因子的互作，后续实验均加入50 μM InsP6。纯化的HDAC1/2-CoREST复合物显示KBTBD4依赖的JL1结合（扩展数据图3e），而单独LSD1–CoREST或HDAC1/2无此现象（图2f及扩展数据图3e）。SAHA以剂量依赖方式抑制FP信号（IC50与其对HDAC1/2的亲和力一致，扩展数据图3d）。此外，UM171仅在KBTBD4存在时抑制LHC对重组核小体的去乙酰化活性（图2g及扩展数据图3f），表明E3复合物阻碍HDAC1活性位点。

TR-FRET验证复合物结合  

利用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术，将CoREST（86-485氨基酸）N端标记荧光素，His-KBTBD4标记CoraFluor-1抗体。UM171以剂量依赖方式诱导TR-FRET信号（EC50=542 nM），SAHA可阻断此效应（图2h）。在UM171及饱和InsP6存在时，荧光素-LHC与His-KBTBD4的KD为13 nM，较基础亲和力提升25倍（扩展数据图3g），与微量热泳动结果一致（扩展数据图3h）。体外实验证实，重组CRL3KBTBD4足以介导LHC泛素化，UM171显著增强CoREST及HDAC1（非LSD1）的泛素化（图2i及扩展数据图3i,j）。综上，UM171通过协同结合稳定KBTBD4与HDAC1/2-CoREST的三元复合物，其中HDAC1/2及InsP6为复合物形成的关键组分。

图2：HDAC1介导LHC–UM171–KBTBD4三元复合物形成

图3：KBTBD4–UM171–HDAC1–CoREST复合物整体结构  

KBTBD4–UM171–LHC复合物的冷冻电镜结构  

在InsP6存在下，我们通过冷冻电镜解析了KBTBD4–UM171–LHC复合物的结构（平均分辨率3.77 Å，扩展数据图4）。三维重构显示KBTBD4与HDAC1清晰可见，而CoREST的ELM2-SANT1域仅部分可见。对比未结合状态的KBTBD4结构（分辨率3.83 Å，扩展数据图5及表1），复合物呈现不对称构型：KBTBD4同源二聚体（KBTBD4-A/B）以双齿状结合单个HDAC1–CoREST（图3a）。CoREST的SANT1域邻近KBTBD4但无直接接触，复合物形成完全依赖KBTBD4与HDAC1的互作：  

-KBTBD4-A：通过4b–4c环的β发夹嵌入HDAC1催化域边缘的疏水裂隙，Phe408/409与HDAC1五个疏水残基（Tyr201、Leu211等）接触，辅以KBTBD4-A Asp407与HDAC1 Arg229的盐桥（图4a）。突变KBTBD4 Phe408/409可阻断CoREST降解（图4b）。  

- KBTBD4-B：以活性口袋区域包裹HDAC1，UM171分子精确填充HDAC1–KBTBD4-B界面间隙，发挥分子胶作用。邻近的InsP6作为第二分子胶，稳定HDAC1、CoREST与KBTBD4-B的三蛋白交界（图4c）。  

KBTBD4结构可塑性  

KBTBD4含BTB、BACK及KELCH重复螺旋桨结构域（图3b及扩展数据图6）。BTB域通过β1/β5链交换形成同源二聚体，BACK域延伸出五段短螺旋，连接KELCH域（图3c）。游离态KBTBD4二聚体呈更开放的V型平台（图3f），其KELCH域间距从结合态的9 Å扩展至30 Å，提示UM171诱导的构象变化对复合物形成至关重要。ENYF基序突变（Δ1–40或29AAAA）可完全阻断UM171功能（图3e），表明BTB N端α1螺旋的正确定位对E3活性不可或缺。  

图4：UM171与InsP6构建双分子胶界面

文章来源：

Megan J R Yeo, Olivia Zhang, et al.UM171 glues asymmetric CRL3-HDAC1/2 assembly to degrade CoREST corepressors.Nature. 2025 Mar;639(8053):232-240.doi: 10.1038/s41586-024-08532-4. Epub 2025 Feb 12.