前言

神经炎症是脑出血(ICH)后继发性脑损伤发生的重要因素。鸢尾素是一种新发现的肌细胞因子。近年来，鸢尾素在海马星形胶质细胞、大脑神经元甚至脑脊液等大脑各区域和细胞群中的存在都得到了证实，且在实验性缺血性中风中具有很强的神经保护作用。然而，这种肌因子是否能在脑出血后发挥神经保护作用尚不清楚。整合素αVβ5在骨细胞和肠上皮细胞中均被鉴定为鸢尾素的功能性受体，有报道称整合素αVβ5在小胶质细胞/巨噬细胞中高表达。鸢尾素是否通过与小胶质细胞/巨噬细胞中表达的整合素αVβ5结合而减轻神经炎症尚不清楚。腺苷5'单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)是是调控生物能量代谢的关键分子。有力的证据表明，AMPK在Tr172位点的磷酸化可以在多种病理生理过程中减轻细胞凋亡和神经炎症，而鸢尾素可以促进AMPK活化，调节能量代谢。本研究旨在探讨鸢尾素治疗对脑出血后神经炎症和神经元凋亡的影响及其与整合素αVβ5/AMPK通路相关的机制。

研究结果

1.脑出血后鸢尾素、整合素αVβ5的细胞表达及时间变化

采用Western blot、ELISA和免疫荧光染色分析鸢尾素及其受体整合素αVβ5的表达。检测脑出血后0 (sham)、3、6、12、24、72 h和7 d同侧/右半脑内鸢尾素和整合素αVβ5的内源性表达。与sham组相比，鸢尾素的表达在3 h和6 h时显著降低，12 h时升高，并在24 h达到峰值(图1A)。整合素αV和整合素β5在ICH后的表达趋势相似(图1A)。采用ELISA法测定脑出血后6 h和24 h血浆中鸢尾素的水平(图1B)。免疫荧光染色显示，整合素αVβ5在脑出血后24 h主要表达在血肿周围组织的小胶质细胞/巨噬细胞(Iba-1+)中，而整合素αVβ5未与小鼠脑内星形胶质细胞和神经元共定位(图1C，D，E)。

2.鸢尾素治疗可减轻脑出血后24和72 h的神经行为缺陷和脑水肿

采用三种不同剂量的鸢尾素，优选其对ICH脑损伤的最佳减毒剂量。通过改进的Garcia试验(p，图2A)、前肢放置试验(图2B)和转角试验(图2C)评估脑出血组在造模24 h时的神经功能缺损。结果显示，给予鸢尾素(250 μg/kg)可显著改善神经系统预后(图2A-C)。脑出血后24 h，与假手术组相比，脑出血组同侧基底节区脑含水量显著增加(图2G)，为进一步验证鸢尾素(250 μg/ kg)的保护作用，在ich后72h进行神经行为学实验和脑含水量测定。在脑出血后72 H，鸢尾素(250 μg/ kg)处理与脑出血+对照组相比，显著改善了同侧基底节区和同侧皮质区神经功能(DF)和脑含水量(H)。因此，选择中等剂量的鸢尾素(250 μg/kg)进行长期和机制研究。

3.鸢尾素治疗改善脑出血后的长期神经行为结果

采用Morris水迷宫(MWM)试验和Rotarod试验评估脑出血后的空间认知功能和运动功能。在脑出血后21-25天的初步学习期间，所有被试组的逃避潜伏期逐渐减少(图3B)。然而，ICH+载体组的逃避潜伏期明显长于载体处理的假手术组(图3B)。ICH+载体组的逃避潜伏期明显高于载体处理的假手术组，尤其是在ICH后第23天和第25天(图3C)。相比之下，ICH+鸢尾素小鼠在第23天和第25天(图3C)与载体处理的ICH小鼠相比，逃逸潜伏期明显减少。为了进一步提供空间记忆缺陷的证据，第26天在没有平台的情况下对小鼠进行了测试，比较了三个非目标象限(NT)的平均时间百分比与目标象限的平均时间百分比。结果显示，假手术小鼠和ICH+鸢尾素小鼠对TQ有明显的偏好，而在灌胃小鼠中没有TQ偏好(图3D)。所有小鼠都有相似的游泳速度(图3E)。结果证实了脑出血后小鼠的空间学习和记忆功能受损，鸢尾素后处理可以显著改善这一功能。

4.鸢尾素可减轻脑出血后24 h神经元的凋亡

免疫荧光染色在如图C所示区域进行。脑出血后24 h后鸢尾素给药组的神经元死亡明显减少（图4A-D）。采用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测，同样发现在ICH后神经元凋亡增加，而在鸢尾素给药后神经元的凋亡明显减少。

5.脑出血后24 h后鸢尾素能抑制小胶质细胞/巨噬细胞活化、中性粒细胞浸润和IL - 1β的表达

脑出血后24 h，采用免疫荧光染色检测小胶质细胞/巨噬细胞活化和中性粒细胞浸润，检测血肿周围区域Iba-1和MPO水平。免疫荧光染色显示，与假手术组相比，ICH+载药组细胞中Iba-1、IL-1β、MPO阳性细胞数量明显增加，而鸢尾素给药能明显改善其增加。此外，Western blot结果显示，与ICH+载体组相比，在ICH后24 h，鸢尾素处理后，同侧半球Iba-1、MPO和IL-1β的表达明显降低。

6.鸢尾素治疗增加了小胶质细胞/巨噬细胞从促炎表型到抗炎表型的表型转换

与ICH+载药组相比，鸢尾素处理后明显降低了ICH后72 h的Iba1+CD16+M1小胶质细胞/巨噬细胞数量，显著增加了Iba1+CD206+M2小胶质细胞/巨噬细胞数量。采用qPCR方法评估M1表型标记物(CD16、CD32、IL-1β、iNOS、IL-6和CD11b)和M2表型标记物(CD206、Arg1、CCL22、TGF-β、IL-13和YM1/2)的mRNA表达水平。与对照组相比，鸢尾素处理小鼠血肿周围M1标记物(CD16、CD32和IL-1β)表达较低，M2标记物(CD206和CCL22)表达较高。综上所述，这些发现表明鸢尾素处理后增加了ICH后小胶质细胞/巨噬细胞从亲炎表型到抗炎表型的表型转换。

7.整合素αVβ5抑制剂可消除鸢尾素对脑出血后24 h神经功能的保护作用

用西伦吉肽抑制整合素αVβ5受体。经行为学评估可知，整合素αVβ5抑制剂的预施用显著你转了鸢尾素的神经行为学益处。此外，检测了整合素αVβ5抑制剂使用后的相关蛋白表达量。结果显示，与ICH+鸢尾素+DMSO组相比，抑制整合素αVβ5后在脑出血后24小时显著降低整合素αV、整合素β5、p-AMPK、Bcl-2的表达，升高了IL-1β、TNF-α、MPO、Bax的表达。

8.AMPK抑制剂可消除鸢尾素对脑出血后24 h神经功能的保护作用

为了评估AMPK信号通路是否参与鸢尾素的神经保护和抗炎作用，使用了一种选择性AMPK抑制剂dorsomorphin进行脑室内注射。结果显示该抑制剂显著消除了鸢尾素治疗后对神经行为的改善。Western blot结果表明，与ICH+载药组比较，ICH+鸢尾素处理后在ICH后24 h显著提高了p-AMPK的表达，同时显著降低了IL-1β和TNF-α的表达。

总结

本文首次发现鸢尾素至少在一定程度上通过整合素αVβ5/AMPK信号通路改善了脑出血后的神经功能缺损、减少脑水肿、改善神经炎症和神经元凋亡。因此，鸢尾素后处理可能为脑出血的早期治疗提供一种有希望的治疗方法。

文献引用：Wang Y, Tian M, Tan J, et al.. Irisin ameliorates neuroinflammation and neuronal apoptosis through integrin αVβ5/AMPK signaling pathway after intracerebral hemorrhage in mice. J Neuroinflammation. 2022 Apr 7;19(1):82. doi: 10.1186/s12974-022-02438-6. PMID: 35392928; PMCID: PMC8988353.

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