环肽是由标准/非标准氨基酸通过远程连接形成大环结构的肽链。自然界中形态、尺寸和化学组成各异的环肽，展现出该分子类别的结构多样性。许多环肽具有显著生物活性，从复杂生物过程信号分子到防御性化学武器，彰显其功能潜力。目前40余种天然环肽或其衍生物已用于临床治疗。此外，环肽作为研究工具同样出色，例如靶向蛋白探针或生物分子成像高亲和配体。首章将通过典型案例展示天然环肽的多样性及应用价值。

环肽适于药物配体的优势源于其环状结构与肽组成的协同效应。相较于线性类似物，环状结构赋予更高结合亲和力、特异性、蛋白酶稳定性及部分情况下的膜渗透性提升。模块化的多肽骨架便于自动化合成与组合库构建，且可通过生物展示系统生成筛选数十亿分子。本文后续章节将深入探讨环肽结构优势及其化学合成便利性。

现有获批环肽药物主要靶向胞外蛋白并通过注射给药，应用范围受限常与其膜渗透性（尤其是大分子极性环肽）较低相关。但部分小环肽可靶向胞内蛋白或实现口服给药，证明其跨膜潜力。后续章节将详述不同尺寸环肽的治疗特性与适用范围。

尽管多数新药仍源自天然环肽研究，近年突破主要得益于新型组合库生成与筛选技术。噬菌体展示（1980年代末）、mRNA展示（约十年后）等技术实现了目标靶点的环肽从头开发。本文后续将探讨相关方法，最后展望环肽领域新兴趋势与挑战。

自然界中引人入胜的环肽  

自然界中，环肽承担宿主防御（植物/真菌/细菌）或激素信号（动物）等重要功能。例如淡水湖蓝藻水华产生的微囊藻毒素（图1a左）具有动物毒性；五环肽尼生素（图1a中）作为食品防腐剂（E234）广泛用于奶酪、肉制品等；向日葵胰蛋白酶抑制剂（SFTI，图1a右）形成双环结构。更复杂的环肽如环胱氨酸结分子（如kalata B1）具有高热/酸碱/酶解稳定性。

超过40种天然环肽或其衍生物已成为药物，包括催产素（图1b左）、万古霉素（图1b中）、环孢素（图1b右）等，其中479种入选WHO基本药物目录（2021版），彰显其医学价值。下文重点探讨人类激素与抗感染剂两大类。

图1  自然界是环肽的宝库。（a）具有显著化学结构、生物活性和特性的天然环肽示例。从左至右：由蓝藻产生的微囊藻毒素-LR对多种动物具有毒性，用于食品防腐的乳链菌肽粉末，以及向日葵种子中发现的双环肽向日葵胰蛋白酶抑制剂（SFTI）。照片由作者拍摄。（b）已被开发为治疗药物并对社会产生重大影响的天然环肽示例。从左至右：用于催产或减少产后出血的激素催产素、抗生素万古霉素和免疫抑制剂环孢素。  

环肽激素药物  

人体激素中多个环肽的合成版本可用于调节生理功能。首例环肽激素药物（1960年代）为催产素与加压素，二者均为含二硫键的九肽（图1b左）。催产素用于催产/减少产后出血，美国每年超150万产妇使用。通过模块化改造，开发出稳定性更优的类似物（如去氨加压素）。生长抑素改造产物奥曲肽（1988年获批）年销售额超10亿美元，后续类似物兰瑞肽/帕瑞肽分别于2007/2012年上市。2019-2020年获批的美黑皮质素4受体激动剂（布雷莫兰肽/司美鲁肽）通过环化线性激素前体提升稳定性与活性。

抗感染环肽  

微生物进化出的抗菌环肽是理想的抗感染药物来源。万古霉素及其衍生物（图1b中）治疗革兰氏阳性菌感染；达托霉素（环脂肽）通过破坏细菌膜起效；多粘菌素B/E靶向革兰氏阴性菌外膜。抗真菌环肽（卡泊芬净/米卡芬净/阿尼芬净）通过抑制β-葡聚糖合成酶发挥作用，均为真菌源天然环肽半合成产物。

环肽的优越特性  

环肽的结合亲和力、特异性、稳定性等优势源于其环状结构。环化可降低结合熵损（图2a），通过构象限制提升结合概率，尤其适用于稳定α螺旋/β折叠构象以抑制蛋白互作（"钉合"技术）。天然环肽与展示技术开发产物常具有单抗级靶向选择性，X射线结构显示其与靶蛋白的形貌/电荷高度互补（相互作用面常超500Ų）。

图2  环化对（a）结合亲和力、（b）稳定性和（c）膜通透性的影响。

稳定性  

环肽相较于线性肽的显著优势在于其更强的抗酶解能力。肽链骨架的柔韧度受限常阻碍其与蛋白酶活性位点的结合（图2b）。例如，肠道主要降解酶胰蛋白酶/糜蛋白酶及血液凝固蛋白酶均需底物适配其催化位点，而环肽因构象限制较难满足此条件。此外，末端环化的肽可规避外切肽酶的降解作用。

膜渗透性  

穿透膜非极性区域需克服肽键氢键供体的去溶剂化能垒。环化通过形成分子内氢键减少极性表面暴露（图2c），提升渗透可能。典型案例环孢素（11肽）通过7个Nα-甲基化及4个分子内氢键实现跨膜，其线性类似物则渗透性显著降低。但环化并非绝对提升渗透性的法则，特定理化性质仍是关键。近期计算设计策略通过分子内氢键屏蔽极性基团，开发出具有良好口服生物利用度的环肽。

化学合成：类乐高模块化构建  

自1901年首个肽合成至今，固相合成（SPPS）、保护策略、偶联试剂等技术突破使自动化合成成为可能。现代合成仪可并行制备50种肽（50μmol规模）或96孔板微量合成（图3a）。商业化的千余种Fmoc氨基酸（图3b）及类肽构建单元，为功能优化提供无限可能。

图3  化学肽合成与环化。（a）96孔板中的自动化固相肽合成（SPPS）。通过针筒和针头将试剂转移至孔中，并通过孔底部的膜抽真空去除试剂。照片由作者拍摄。（b）市售氨基酸构建块的可用性，显示主要供应商提供的现货Fmoc氨基酸种类数量。带星号（*）的数据为估算值。（c）化学肽合成中常用的环化反应。 

 环化策略  

天然环肽常见环化方式包括二硫键、内酰胺/内酯键等（图3c）。化学环化主要采用二硫键氧化、内酰胺化、硫醇烷基化、CuAAC点击化学及关环复分解（RCM）等方法。短肽构象限制及分子间副反应是主要挑战，建议在低浓度（<1mM）下进行。硫醇环化效率最高，内酰胺化收率波动较大，CuAAC与RCM则官能团耐受性更佳。

药物开发：膜渗透型与非渗透型  

近30年获批的40余种环肽药物中（图4a），多数为靶向胞外蛋白的大分子极性肽（>10个氨基酸），需注射给药。少数小分子环肽（<1kDa）通过降低极性表面积（如N-甲基化）实现膜渗透，靶向胞内"不可成药"靶点（图5）。口服给药仍面临酶解、上皮屏障等挑战，目前仅环孢素、去氨加压素等极少数成功案例。默克公司开发的PCSK9三环肽（皮摩尔级亲和力）联用渗透促进剂，在猴模型实现2.9%口服生物利用度，展现突破潜力。

图4  环肽治疗药物。（a）过去30年间获批用于医疗的环肽药物。红色标记的为具有全新结构或作用机制的药物，与已获批药物无相似性。（b）图a中红色标记的9种环肽药物结构。对于仅含标准氨基酸的长肽，展示了其氨基酸序列和二硫键。

胞外靶向肽药物  

>10个氨基酸构成的大环肽因极性侧链丰富，主要靶向胞外蛋白。其组织渗透快、肾清除迅速的特性，正被用于肿瘤标志物成像/靶向递送。虽有尝试整合穿膜肽段或α螺旋钉合技术提升胞内递送，但渗透效率仍逊于经典小分子药物。

细胞穿透型环肽  

小环肽（如环孢素、罗米地辛）通过被动扩散靶向胞内PPI等"难治"靶点。关键参数包括分子量、logP值、极性表面积及氢键供受体数。Kritzer团队开发的CAPA检测法可精确量化胞浆药物浓度，突破传统显微技术的局限。

口服环肽药物  

一系列具有生物活性的环肽（大多源自天然产物）被发现具有口服可利用性，证明了通过口服途径应用这类分子的可行性。口服给药相比注射策略具有显著优势，例如患者使用更便利、剂量调节更灵活，以及由于胃肠道缓慢释放带来的更持久的药物暴露时间和更低的血药峰值浓度。然而，口服药物必须克服多重障碍，例如抵抗胃和肠道中高强度的蛋白酶压力、穿过上皮屏障进入血液，以及避免首过代谢效应。  

目前仅有少数环肽药物可实现口服利用。例如环孢素（尽管其分子量高达1203 Da却仍能被动跨膜）、前文所述具有膜通透性的HCV蛋白酶抑制剂，以及人源激素药物去氨加压素。去氨加压素的口服生物利用度不足1%（与其他药物相比，口服给药与静脉注射等剂量下的血浆浓度比值异常低），但由于该环肽的高效性仍能实现治疗效果。现有多种策略可改善多肽的口服利用度，其中多数聚焦于减小分子尺寸和极性表面积，并增强抗蛋白水解稳定性。其他提升多肽药物口服利用度的策略基于制剂技术，例如肠溶包衣、添加蛋白酶抑制剂或渗透促进剂。例如，默克公司通过卓越的工程化努力开发的三环肽（与PCSK9——血浆LDL-胆固醇的关键调控因子——以皮摩尔级亲和力结合）在食蟹猴实验中结合渗透促进剂后实现了2.9%的口服生物利用度。

环肽配体开发  

凭借其化学与结构多样化的构建单元及近乎无限的三维构型可能性，环肽为靶向最具挑战性的目标（包括蛋白-多肽相互作用）提供了独特平台。然而，自然界并未为每个理想靶标进化出配体，因此我们需要借鉴天然环肽的设计原理，开发针对新蛋白的环肽配体。该领域的研究可分为理性设计策略、大规模随机环肽库筛选，或两者结合。

环肽的理性设计  

幸运的是，自然界为我们提供了大量可供学习的环肽实例。设计策略充分利用现有已知肽配体的序列、结构和功能数据（这些数据日益丰富），通过分析现有结合剂信息及设计思路，通常仅需合成少量多肽即可发现有效配体。  

在环肽开发过程中，多数设计方法以天然蛋白或与靶标结合的天然多肽中的短肽基序为起点。线性多肽在溶液中构象灵活且通常结合力较弱，因此通过环化可将其锁定于类蛋白生物活性构象（如β折叠、α螺旋或转角）。例如，Robinson团队采用D-Pro-L-Pro模板环化多肽，完美模拟II’型β转角并稳定β发夹结构；前文提及的α螺旋多肽则通过引入构象稳定"订书"连接体实现固定。22a,22b 设计过程的关键在于确定合适的环化位点和连接体，使目标构象稳定呈现。所得环肽可展现类蛋白生物活性和效力，作为生物探针或诊疗与疫苗开发先导物。另一策略是将靶标结合区段移植至具有明确结构的更大肽骨架（如环肽毒素）。这种结构能更好固定结合基序构象以提升亲和力，且已证明可产生高抗蛋白酶降解的体系。   

近年来，创新计算方法（如从头设计与虚拟筛选）为理性设计注入新动力。专为计算建模与蛋白分析开发的Rosetta软件等工具已成功应用于环肽配体设计。例如，基于弱结合活性的D-Cys-L-Pro二肽配体设计的金属β-内酰胺酶环肽抑制剂，其效力提升达50倍； 此外，通过小分子锌螯合剂结合多种环肽构象采样，成功设计出组蛋白去乙酰化酶抑制剂。 然而，现有方法仍需依赖已知结合基序作为起点，尚无法实现基序的从头设计。尽管结合特性设计仍具挑战性，但如前所述，通过计算设计膜通透性多肽已取得重大进展。  

生物筛选：噬菌体与mRNA展示  

噬菌体展示技术革新了环肽配体开发，使快速生成并筛选数百万多肽以获取任意靶标配体成为可能。在噬菌体展示环肽时，展示于噬菌体尖端且由病毒颗粒内DNA编码的多肽需在亲和筛选前完成环化。早期研究通过一对半胱氨酸在空气中氧化自发形成二硫键实现环化；后续采用硫醇反应性化学连接体桥接半胱氨酸，既保证氧化还原稳定性，又可构建双环肽等复杂结构。目前已开发出纳摩尔至皮摩尔级亲和力的双环肽，靶向包括肿瘤标志物在内的多种靶标，部分已用于构建处于临床试验阶段的双环肽-药物偶联物（BDC）。

另一强大技术是mRNA展示。该技术通过核糖体翻译将多肽共价连接至编码mRNA。相比噬菌体展示（库容量受限于DNA转化效率），mRNA展示的无细胞体外特性可构建更庞大的文库，并轻松引入非经典氨基酸。Suga团队开发了高效引入结构多样化非天然氨基酸（含氯乙酰胺基团，可与同一多肽的半胱氨酸反应实现高效大环化）的智能方法；其体系还可引入N-甲基化氨基酸以生成膜通透性环肽。中外制药近期开发的新型mRNA展示技术可高效整合大量N-甲基化氨基酸，成功获得靶向重要肿瘤靶标KRAS的环肽抑制剂LUNA18，该分子不仅具备膜通透性，更在动物模型中展现出21–47%的卓越口服生物利用度。

另一生物高通量筛选方法是分裂内含肽环化连接技术（SICLOPPS）。该技术通过将随机肽与内含肽片段融合表达，利用自剪切反应在细菌细胞内形成环肽，并通过双杂交报告系统直接检测环肽活性。  

化学筛选：OBOC与DNA编码库  

针对含非经典构建单元的文库筛选，1990年代发展了"分-合"固相合成策略。早期基于"一珠一化合物"（OBOC）技术：单个微珠携带单一多肽的多个拷贝。通过分组合成、质谱鉴定筛选阳性珠。

新近发展的DNA编码库（DEL）技术为筛选含非经典氨基酸的环肽/大环化合物提供可能。在开创性工作中，刘团队采用DNA模板化学构建环肽DEL；后续研究通过"分-合"法在每轮合成中同步添加氨基酸与DNA编码片段。DEL最大优势在于可筛选超十亿级化合物库，但对环肽而言，多步偶联反应（包括大环化步骤）可能影响库质量并增加配体解码难度。  

纳米级合成与功能筛选  

一种概念简洁的技术路线是：在微孔板中微量合成含非天然氨基酸的环肽库，直接筛选粗产物。虽然库容量受限，但新技术已实现万级环肽库构建。例如，自动化高通量合成可制备数千高纯度多肽；新型组合环化方法通过无接触声波移液技术实现纳摩尔级化学片段偶联与库多样化。此类文库已成功筛选出针对蛋白酶等模型靶标及蛋白-蛋白相互作用等难靶点的配体。

总结与展望  

环肽因其独特性质持续吸引研究者关注：三维结构赋予其与生物靶标相互作用的多维可能性。作为药物形态，环肽领域正迎来爆发式发展：基于天然环肽的成功药物开发、新生代环肽的临床评估、突破膜通透性与口服利用度瓶颈的创新方法，以及计算与实验方法整合的未来愿景。本文重点探讨后两个前沿方向——膜通透/口服环肽药物的最新突破与未来展望。  

当前核心目标是利用环肽优异结合特性靶向胞内难治蛋白并开发口服药物。膜通透性与稳定性不足仍是主要瓶颈。近年研究深化了对环肽跨膜机制的理解，这些洞见正指导设计适于胞内靶标与口服应用的环肽库。通过构建小尺寸、低极性表面积的环肽库并结合新型筛选技术（如mRNA展示整合多N-甲基化氨基酸），膜通透性配体开发取得显著进展。OBOC与DEL技术可灵活引入N-烷基化等非天然氨基酸，助力膜通透配体开发。亲和选择质谱（AS-MS）等新技术已成功应用于含非天然氨基酸多肽筛选，未来或可拓展至环肽领域。  

本实验室开发了纳摩尔级万级膜通透环肽库合成方法，并筛选出靶向蛋白-蛋白相互作用等难靶点的配体。虽然单项技术创新已推动领域进步，但多技术联用将加速突破——膜通透/口服环肽药物的种类必将快速扩充。  

展望未来，我们期待细胞通透性与口服药物在挑战性靶标与疾病治疗中实现爆发式发展。虽然物理筛选规模受限于合成与筛选能力，但计算方法有望探索更广阔的化学空间——类似小分子药物的虚拟筛选。通过计算预筛理论可能的环肽（例如利用现有商业构建单元可组合形成超过10¹⁸种六聚环肽），结合机器学习筛选出最可能具备高膜通透性或抗蛋白酶特性的候选分子（如10⁵量级），再进行实验验证，这种模式将极大提升开发效率。未来，大规模环肽合成/测试技术与计算/人工智能方法的深度融合，必将推动高效环肽药物的加速诞生。

文章来源：

Xinjian Ji, Alexander L Nielsen, Christian Heinis.Cyclic Peptides for Drug Development.

Angew Chem Int Ed Engl. 2024 Jan 15;63(3):e202308251.doi: 10.1002/anie.202308251. Epub 2023 Oct 23.