尽管大环肽库在配体发现与开发中潜力巨大，但大规模合成大环肽库的制备一直受限。美国麻省理工的一项研究成功构建了包含天然与非天然氨基酸的10亿成员大环肽库。通过溶液中碘的快速氧化反应，可实现接近定量的分子内二硫键形成。在亲和选择实验后，利用二硫苏糖醇（DTT）处理实现近乎完全的二硫键还原，生成线性肽类似物以适配标准串联质谱分析。我们应用该肽库发现了与钙黏蛋白-2（Cadherin-2）及抗血凝素抗体克隆12ca5结合的大环配体。通过对初始钙黏蛋白结合肽（CBP；表观解离常数Kd=53 纳摩尔）的结构-活性关系研究，明确了驱动亲和力的关键残基（热点残基）及耐受突变的非关键残基（冷点残基）。随后，基于这些热点与冷点残基的非天然氨基酸修饰，构建了两种新型大环肽库。通过筛选与验证，从冷点残基修饰库中发现了高亲和力配体，其中NCBP-4的亲和力显著提升（Kd=29 纳摩尔）。总体而言，我们预计此项工作将推动大环肽库在治疗性肽开发中的广泛应用。

引言  

大环肽在治疗领域展现出巨大潜力，其优势体现在相较于小分子能更有效破坏蛋白质-蛋白质相互作用，相较于蛋白质则具有更强的跨生物膜能力。具体而言，大环化可为线性前体肽带来多重潜在优势，包括增强的蛋白酶稳定性、细胞渗透性、结合亲和力及口服生物利用度。蛋白酶通常通过与β-链构象的肽结合并降解之。大环化可通过限制肽骨架在酶活性位点的构象可及性，提升抗蛋白酶降解能力，并允许使用特定可工程化支架（如钉合α螺旋）。除调节分子量、极性表面积、氢键相互作用及形状等策略外，环化是实现被动细胞渗透性的核心设计原则。将蛋白酶稳定性与被动渗透性结合，可赋予肽类候选药物口服生物利用度，并通过药物制剂进一步优化。因此，大环肽库更适用于基于亲和选择的肽配体发现平台。此外，直接从中筛选大环肽配体可省去优化环化位点的步骤，简化后续开发流程。最后，大环化带来的构象约束可能提高针对难治靶点的配体发现效率。

基因编码的发现平台通常可构建高多样性（>10⁸成员）的大环肽库，而合成肽库虽多样性较低（<10⁸成员），但能引入非天然化学空间。尽管更稳定的环化连接方式更受青睐，但二硫键在配体发现阶段仍适用，且无需化学修饰或处理（某些平台需避免影响基因扩增）。二硫键用于构建大环肽库已有二十余年历史，常见于噬菌体展示平台及临床获批药物中，如治疗尿崩症的加压素类似物、治疗类癌综合征及胃肠疾病的生长抑素类似物（奥曲肽、兰瑞肽），以及调节钙水平及治疗骨质疏松的降钙素。

尽管二硫键广泛存在于临床药物中，但在先导化合物优化阶段常被替代。现有策略包括硫醚键、酰胺键、碳桥、二硒键及三唑桥。这些方法已应用于肽配体及激素，并为候选药物的二硫键替代提供参考。从二硫键出发进行替换是早期开发的常规步骤，可能影响肽的二级结构及靶标结合。根据靶标结合模式，替换为更稳定的类似物可能对功能产生正向、负向或中性影响。因此，二硫键替换常在先导化合物优化阶段早期研究，以恢复或提升因替换导致的效价下降。然而，二硫键的化学可逆性与易用性仍使其在大规模合成库中具有独特优势。

合成肽库广泛利用非天然化学基团，这些基团对临床肽类药物的成功至关重要，如针对白细胞介素-23受体、小鼠双微体2、β-连环蛋白及前蛋白转化酶枯草溶菌素9的抑制剂。采用二硫键大环化的合成库无需额外纯化步骤，即可高效构建环化结构。由于无法基因编码或扩增，合成库需直接筛选，如通过质谱解码的亲和选择（AS-MS）。除DNA编码库外，现有合成大环肽库规模通常低于数万成员，而本研究使用的库规模达10⁸成员。

质谱（MS）解码大环肽序列的复杂性长期制约合成大环肽库在亲和选择平台的应用。现有解码策略包括质谱数据计算处理及化学触发线性化。计算方法通过解析环肽片段的一级、二级及三级质谱，在数据库匹配场景下表现优异。对于从头测序，随着单体数量及库规模增加，虚拟谱枚举复杂度显著上升，目前仅能处理约千成员库。化学线性化需近乎定量的高产率步骤以实现非环肽自下而上测序，已在极高多样性库中验证。但多数化学线性化条件苛刻或依赖固定位点的非标准化学基团，限制了库组成。基于末端环化的方法对结构多样性存在固有局限，而侧链间环化可能缓解这一问题。然而，这些方法尚未在超大规模库（~10⁸成员及以上）中验证。基因编码技术（如mRNA展示）因测序依赖RNA链而非肽结构，可采用更稳定的环化策略。但合成肽库能轻松引入非天然氨基酸，尤其在需连续多个非天然残基时。尽管mRNA展示技术正扩展非天然氨基酸应用范围，合成库的灵活性仍支持更广泛的配体空间探索。

本研究通过AS-MS技术从10⁸成员库中发现针对抗血凝素抗体克隆12ca5（简称12ca5）及小鼠钙黏蛋白-2（CDH2）的配体。利用碘水溶液实现二硫键环化，并通过埃尔曼法及尺寸排阻色谱（SEC）验证库的完整性，确认合成组合库的分子内环化近乎定量。温和加热及二硫苏糖醇（DTT）还原实现线性化，经埃尔曼法验证后适配标准串联质谱（MS/MS）测序。我们将含天然与非天然氨基酸的大环高多样性库应用于基于质谱的亲和选择平台，实现从头肽配体发现。

结果

1.亿计规模大环肽文库设计与构建

如下图，研究人员设计了两种类型的文库：CX₁₂CK、X₆CX₆CK。

其中 X 代表除半胱氨酸（Cys）和异亮氨酸（Ile）以外的 18 种典型天然氨基酸，（排除 Cys 是为了控制二硫键的形成，排除 Ile 是因为它与 Leu 分子质量相同）。C 为 Cys 及其类似物（高半胱氨酸、青霉胺）。

研究人员采用 20 μm 树脂（8.33 g树脂，共2.00 mmol），采用 “拆分-合并” 固相合成方法合成大环肽文库。

如下图 A，采用 Ellman 测试法定量测定硫醇氧化，检测在 280 nm吸收光下的归一化吸收，可以看出碘促进高效环化。

图2. 基于分子量及巯基浓度的表征证实分子内二硫键近乎定量形成  

（A）埃尔曼法检测显示：肽链从树脂切下后（初始）、经逐滴加入约1当量60 mM碘甲醇溶液氧化（室温避光反应5–10分钟，随后用3.5当量抗坏血酸水溶液淬灭），以及DTT还原（50 mg/ml，约1000当量，60°C 15分钟）后的游离巯基浓度变化。氧化过程中巯基被定量消耗，线性化后巯基浓度恢复至切下后水平。（B和C）基于214 nm吸光度的尺寸排阻色谱图显示：两种大环肽库（环化态及DTT线性化态）的分子量分布与标准品（单体、二聚体及三聚体平均分子量）对比，证实分子内二硫键形成。标*峰为样品缓冲液残留成分。C=半胱氨酸、高半胱氨酸及青霉胺。

合成的文库硫醇换了经裂解、冷醚研磨、SPE、去除剩余的还原剂后，采用 Ellman 试剂测定完整性。

如下图所示，与标准肽相比，只观察到单体文库物种，表明形成的二硫键是分子内而不是分子间的。

图3. MS/MS测序表征证实15肽大环肽库成功通过分割-合并法合成  

（A）大环肽库设计包含大环（12元环）与小环（6元环）两种结构，并使用半胱氨酸类似物（高半胱氨酸、青霉胺）增加二硫键周围多样性。（B）对约1000成员库样本（切下后、碘氧化后、DTT还原后）的高置信度序列鉴定显示：环化过程导致测序能力丧失，线性化后恢复（n=3）。高置信度序列定义为经PEAKS Studio 8.5计算的局部置信度平均值>85%，绝对质量误差<5 ppm。（C）归一化残基频率分布显示：可变位点（黑色）及半胱氨酸类似物位点（绿色；X=高半胱氨酸，Z=青霉胺）的氨基酸均衡引入。

从数据中也可以看出，与CX12CK文库设计相比，X6CX6CK 文库设计总体上具有更高的置信度，这表明在序列分配中片段事件期间中间Cys 位置的优势。

总的说来，这些结果说明大环肽文库的 “拆分-合并” 合成、氧化环化、还原线性化和串联质谱测序解码是成功的。 

2. 抗血凝素抗体12ca5的配体发现

首先，研究人员以 12ca5 作为模型蛋白靶标，进行AS-MS 的大环肽文库的 POC 筛选验证。以已知的靶标结合序列 D**DY（A/S）肽段序列作为 AS-MS 文库筛选的基准。

筛选结果表明，从 X6CX6CK 设计文库中拉下 7 个高亲和肽配体，而从 CX12CK 设计文库中仅拉下 1 个肽配体。

图4. 通过AS-MS富集鉴定12ca5高亲和力大环肽配体，BLI验证结合亲和力  

所有肽的N端连接赖氨酸（生物素）-氨基己酸（Ahx）并固定于BLI传感器。传感器浸入含不同浓度12ca5的溶液中，记录浓度依赖性结合与解离曲线。12ca5特征结合基序D**DY(A/S)（红色标注）在X₆CX₆CK库中仅出现于单一位置（发现7个含基序肽），而CX₁₂CK库仅发现1个。

使用生物层干涉法（BLI）合成并验证了这些序列的结合亲和力。所有鉴定的结合物在低 nM到高 pM 范围内表现除明显的解离常数（Kd），接近仪器检测的下限，如上图。

结合基序在 X6CX6CK 文库中发现的所有序列中都存在于相同的位置或移码。尤其是库设计中间的Cys 类似物位于 12ca5 基序的第三个位置，即D*ΨDY(A/S），其中Ψ是Cys，同型Cys或青霉胺。

2. CDH2结合肽的发现与优化

针对 CDH2 ，利用AS-MS，从两个文库中均发现了 nM 级肽配体。其中一种具有高测序置信度的肽被鉴定为针对 CDH2 富集，即下图中CBP。

图5. 大环肽库实现CDH2胞外域片段53 nM肽配体的发现  

（A）CBP结构。（B）BLI实验显示CBP对CDH2的亲和力（Kd=53 nM）。所有肽的N端连接赖氨酸（生物素）-Ahx并固定于传感器，浸入不同浓度CDH2溶液中记录结合曲线。（C）单肽SAR研究（丙氨酸扫描、D-氨基酸扫描及N端截断）数据总结。“NB”表示无结合。SAR信息用于定义CBP的“热点”（驱动高亲和力结合）与“冷点”（无显著贡献）。

通过 BLI 合成并测试了 CBP 与 CDH2 的结合亲和力，Kd= 53 nM。此外，研究人员也合成了 CBP 对应的线性肽结构，其Kd = 150 nM。对比表明，大环化的 CBP 的刚性结构更有利于获得高亲和力。

随后，研究人员针对 CBP进行了单残基替代研究，以进行SAR 探究，包括丙氨酸扫描和D-氨基酸扫描、截断片段研究。

Cys7-Pen14 二硫键在所有的SAR探究中被保留，以提供一个一致的大环结构进行优化。

首先，通过合成具有单个丙氨酸突变的13个变体进行丙氨酸扫描，并用 BLI 对 CDH2进行检测。结果表明，多个残基对Hotspot 结合很重要，包括Lys4、Phe6、Lys12、Lys15，当替代它们时，肽与靶标的结合完全消融。

其它残基，如Met2、Thr3、Leu5、Thr10、Tyr11、和Asp13 对结合没有影响（Coldspots）。

其次，截断研究侧重于从N端缩短CBP，产生5个额外的肽用于 BLI 测试。结果验证了N 端残基对结合亲和力的重要影响，尤其是Phe6、Leu5，而Met2、Thr3对靶标结合贡献最小。

下一个第三，通过D-氨基酸扫描，确定了立体化学对配体相互作用的影响。结果发现Phe6、Tyr11的立体重要性，也进一步强化了芳香残基对结合的重要性。

综上所述，这些初步的 SAR 研究概述了似乎驱动 CBP 与 CDH2 高亲和力结合的热点残基，包括Lys4、Phe6、Lys12和Lys15，而Met2、Thr3、Leu5、Thr10和Asp13被指定为对结合影响最小的冷点。

SAR 数据为基于 CBP 的两个集中性文库的设计提供了信息：一个衍生出高亲和力的热点残基，另一个衍生出非结合必需的冷点残基。

此前设计非典型文库的方法是使热点多样化，然而，肽的开发和优化往往也会考虑到冷点残基不驱动高亲和力结合的靶标。

这些冷点残基对于改善结合亲和力、溶解度或蛋白水解稳定性具有非直观的关键作用。因此，研究人员选择比较两种成熟策略的结果。

如下图，根据对接、丙氨酸扫描、D-氨基酸扫描、姐u但研究提供的数据，选择纳入热点和冷点的集中型文库对的非典型氨基酸集。

图6. 单肽SAR研究指导组合库设计与非天然氨基酸亲和成熟

（A和B）基于图5C的SAR数据，设计两种亲和成熟库：热点库通过匹配天然氨基酸性质（如疏水性、正电荷）微调热点残基；冷点库通过多样化冷点残基探索其优化可能。两库采用分割-合并法合成，实际珠粒数与理论多样性匹配（热点库：珠粒数2.5×10⁶，理论序列多样性2.7×10⁶；冷点库：珠粒数7.0×10⁵，理论多样性7.2×10⁵）。（C）通过亲和选择发现的NCBP-4序列、结构及其BLI结合响应（Kd=29±5 nM）。Nal=3-(2-萘基)-L-丙氨酸；Pip=4-氨基哌啶-4-羧酸；C5g=环戊基甘氨酸；Hyp=L-反式-4-羟基脯氨酸。

通过设计冷点替代为非天然氨基酸，优化冷点集中型文库，进而筛选出了新的肽段，NCBP-4，其结合解离常数 Kd= 29 nM，结合响应提升了 2 倍，蛋白酶半衰期更是延长了 40 倍（5分钟→200分钟）。

讨论

我们建立了一套高多样性大环肽库的分割-合并合成方案，并验证了其在发现针对两种不同结构蛋白靶点的纳摩尔级配体中的应用。大环化通过简单的二硫键实现，该键可在水溶液中利用碘快速形成。通过Ellman法对环化与线性化形式的游离巯基定量分析证实，文库中巯基已完全转化为二硫键；尺寸排阻色谱（SEC）进一步表明二硫键仅以分子内形式存在，未发生寡聚化。尽管二硫键并非最稳定的环化连接方式，但在需要提升治疗性分子稳定性时，可通过多种方法替代。此类策略需精确控制键合距离。然而，硫醚键或内酰胺环化等化学稳定性更高的连接方式通常难以线性化，需苛刻条件或固定氨基酸位点。本研究中，二硫键连接不仅兼容含非天然巯基的残基，且无需在文库合成与制备中增加额外步骤。  

通过亲和选择，我们从合成大环肽库中成功筛选出针对模型蛋白（12ca5）及第二靶标钙黏蛋白-2（CDH2）的特异性配体。CDH2参与神经与心脏代谢功能中细胞的基础生物黏附。经典肽CBP与非经典肽NCBP-4均表现出浓度依赖性CDH2结合能力、结合特异性及高亲和力，其Kd值分别为50和29纳摩尔。通过分析CBP的结构-活性关系（SAR），发现多个疏水性与阳离子型残基作为热点残基对CDH2结合至关重要。  

基于SAR研究，我们进一步合成了两种新型大环肽库，分别针对驱动亲和力的“热点残基”与非关键“冷点残基”，并引入多样化非天然氨基酸。后续亲和选择实验验证以下假设：通过针对性文库设计，热点残基是否可进一步优化？或冷点残基是否能在成熟过程中显著提升结合亲和力？结果显示，针对CDH2热点残基的文库未筛选出优于原始CBP的配体；而冷点残基修饰文库中则发现多个经单独验证的高亲和力候选分子。其中，NCBP-4因高亲和力（Kd≈29纳摩尔）、特异性及冷点残基替换后侧链的功能贡献而被重点研究。  

通过在组合合成的大环肽库中使用非天然氨基酸，我们实现了CBP的亲和力成熟，其成功源于冷点残基被非天然单体取代。总体而言，由于大环化相较于线性肽骨架常具显著优势，本研究有望为大环合成肽库的深度开发提供基础支持，推动治疗性肽药物的发现与研发进程。  

文章来源

Michael A Lee,Joseph S Brown,Charlotte E Farquhar,Andrei Loas,Bradley L Pentelute.Affinity selection-mass spectrometry with linearizable macrocyclic peptide libraries.Sci Adv. 2025 Mar 21;11(12):eadr1018.doi: 10.1126/sciadv.adr1018. Epub 2025 Mar 19.

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