药用植物孩儿参中存在的活性环肽（orbitides）因含量低微难以发现。本研究通过瞬时表达与病毒诱导基因沉默（VIGS）技术鉴定出关键环化酶PhPCY3，并利用底盘平台生物合成四种新型环肽。这一反向遗传学策略克服了天然产物稀缺性限制，为开发这类高价值化合物提供了新途径。

摘要  

石竹科型环肽（又称orbitides）作为传统中药孩儿参（Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax）的重要活性成分，在改善记忆与治疗糖尿病方面潜力显著。尽管已知这类环肽为核糖体编码并经翻译后修饰的产物，其关键生物合成酶在孩儿参中尚未明确。本研究通过多组学数据分析，系统解析了孩儿参中环肽的组织分布特征，挖掘出新型前体肽基因及肽环化酶。借助本氏烟瞬时异源表达体系与活体VIGS技术，验证了核心修饰基因PhPCY3的功能：该基因通过催化线性前体肽环化，介导异叶素B（heterophyllin B）、银柴胡素E/F/G（pseudostellarin E/F/G）等已知活性环肽的生物合成。分子对接与定点突变实验显示，PhPCY3的N500与S502位点通过氢键相互作用参与底物识别。进一步基于转录组数据筛选的百余个前体肽基因，利用异源表达平台首次发现环-[LDGPPPYF]、环-[WGSSTPHT]、环-[GLPIGAPWG]和环-[FGDVGPVI]四个新型环肽。本研究建立的基因导向策略不仅阐明了孩儿参环肽生物合成通路，更为植物环肽资源的系统性开发提供了方法论支持。

引言  

石竹科植物孩儿参是中国传统药材，其块根制剂被用于治疗脾虚食少、病后体虚及自汗等症状，市场价值达数亿元。栽培品种块根中提取的异叶素B（HB）是《中国药典》质量控制核心指标，可通过促进神经突触可塑性改善β淀粉样蛋白诱导的记忆损伤，并作为二肽基肽酶IV抑制剂与GLP-1受体激动剂，显示出治疗2型糖尿病的潜力。全球范围内，以兰瑞肽（lanreotide）和司美格鲁肽（setmelanotide）为代表的环肽药物已形成百亿美元级市场，其构象稳定性、代谢抗性与口服利用度优势显著。

植物环肽（CPs）作为核糖体合成-翻译后修饰肽（RiPPs），通常含4-37个氨基酸，具有头尾环化（orbitides/cyclotides）、侧链环化等多种形式。其中，由5-16个氨基酸构成且不含二硫键的orbitides最早发现于石竹科植物，如首例环肽evolidine（环-[SFLPVNL]）及孩儿参中的异叶素A-H/J、银柴胡素A-H/K系列。传统植化方法受限于低丰度成分分离难度，可能遗漏新型环肽。

环肽生物合成通常涉及前体肽基因编码的线性肽经剪切酶（如天冬酰胺内切酶AEP、寡肽酶OLP1）与环化酶（如丝氨酸蛋白酶PCY1）协同加工。尽管已知孩儿参韧皮部粗酶液可催化PhPreHB基因编码的异叶素B合成，其环化机制仍不明确。本研究通过多组学整合分析，系统揭示了孩儿参环肽生物合成通路，为规模化发掘植物环肽资源提供了关键技术突破。

结果  

1. 孩儿参环肽的组织特异性积累  

通过LC-MS分析不同组织（图1A）发现，异叶素B（HB）与银柴胡素E/F/G（PE/PF/PG）特异性富集于块根（图1B-C，补充图1-2），其中HB含量达38.4 μg/g鲜重，显著高于PE（4.4 μg/g）与PF（7.6 μg/g）（图1D）。

2. 环肽生物合成通路候选基因筛选  

转录组与基因组关联分析筛选出PhPCY1/2/3与PhOLP1/2等候选基因（图2A），其表达水平与环肽含量呈强正相关（Pearson相关系数>0.90，图2B-C）。系统发育分析表明PhPCY3与石竹科模式环化酶SvPCY1亲缘关系最近。

3. PhPCY3介导环肽合成的功能验证  

本氏烟瞬时表达实验证实：PhPCY3可独立催化前体肽环化生成HB（图3A-B），且能介导PrePE/PrePF/PrePG转化为PE/PF/PG。体外酶活实验显示，PhPCY3特异性切割HB线性前体的C端（图3C-D），生成HB主产物与SQELINGDDISLMV副产物（图3D），但对截短底物HB无催化活性（图3E）。

 4. VIGS验证PhPCY3体内功能  

利用叶绿素合成关键基因ChIH1构建VIGS阳性对照（图4A-B），沉默PhPCY3导致植株各组织环肽含量显著下降（图4C-D），且前体肽基因PhPreHB/PhPrePE/PhPrePG表达同步下调。

 5. PhPCY3关键催化位点解析  

分子对接显示PhPCY3通过N500/S502位点与前体肽C端形成氢键网络（图5A）。定点突变实验表明：N500A/S/T或S502A/T突变使HB产量下降50-80%，双突变（N500A+S502A）则完全丧失活性（图5C）。

6. 新型环肽的发现  

基于转录组挖掘的百余个前体肽基因（图6A），利用PhPCY3异源表达平台成功合成四个新型环肽（图6C-J），其二级质谱碎片与预测序列完全匹配（图6D/F/H/J）。

讨论  

长期以来，天然产物的发现主要依赖于生物活性导向策略。然而近年来，多组学数据的爆发式增长推动了基因导向的新型天然产物发现方法的发展。值得关注的是，通过基于酵母的基因组挖掘平台对真菌嵌合I类三萜合成酶的分析，已成功鉴定出非角鲨烯型三萜类化合物。具有多样化化学结构与生物活性的环肽广泛分布于植物界。植物环肽作为核糖体合成-翻译后修饰肽（RiPPs），尤其适合通过基因导向策略进行新型环肽鉴定。Fisher团队通过从头转录组学与串联质谱技术，在黄木香（Melicope xanthoxyloides）中重新发现了evolidine及六个新型orbitides。Song等开发了复杂挖掘策略，通过分析亚麻（Linum usitatissimum）基因组特异性序列研究orbitides的遗传多样性。这些序列包含多个核心肽区域（CPRs），与孩儿参（P. heterophylla）和黄木香中单CPR的orbitides形成鲜明对比。值得注意的是，本研究在孩儿参转录组中鉴定了多种潜在orbitides前体肽基因，表明植物体内可能存在着尚未被分离的环肽类化合物。

Orbitides作为植物环肽中不含二硫键与非天然氨基酸的第二大类群，其前体肽序列在芸香科多个属中通过RNA测序与全基因组测序数据被大量发现。这些肽段在CPRs的C端具有苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）或赖氨酸（Lys）等多样化残基，这些残基无法被天冬酰胺内切酶（识别Asn/Asp）或脯氨酰寡肽酶（识别Pro/Ala）识别，提示芸香科中可能存在尚未被发现的新型修饰酶。孩儿参块根中环肽的发现始于20世纪90年代谭宁华与Hiroshi Morita团队的传统植化研究，而近年仅在须根中鉴定的银柴胡素K进一步表明，传统方法在低含量天然产物分离方面面临瓶颈。

多组学数据为解析orbitides生物合成通路候选基因提供了重要支持。本研究从转录组数据中鉴定出大量前体基因（图6A）。核心肽段氨基酸序列相较于两侧保守序列呈现显著多样性，但其C端残基始终为脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）（图6B），这与SvPCY1的底物识别特性一致。丝氨酸蛋白酶SvOLP1可将线性前体肽presegetalin A1剪切为presegetalin A，随后SvPCY1通过切割C端presegetalin A1 并催化核心肽环化生成segetalin A。基于这些机制，推测孩儿参基因组中相关基因参与orbitides生物合成（图2）。本氏烟瞬时表达平台证实PhPCY3无需OLPs辅助即可介导orbitides合成（图3A-B），体外酶活实验进一步显示PhPCY3通过切割HB底物C端催化前体肽环化（图3C-D）。尽管S9家族蛋白酶在自然界广泛存在，但具有肽连接酶活性的成员极为稀有。因此，PhPCY3成为继SvPCY1之后第二个被验证的orbitides环化酶。

既往研究表明，部分RiPP修饰酶（如噻唑/恶唑修饰微菌素（TOMM）生物合成相关酶）通过识别前体肽N端保守序列发挥作用。天冬氨酸内切酶（AEPs）作为半胱氨酸蛋白酶，通过水解与转肽反应在植物环肽剪切环化中起关键作用。Karen团队从茜草科植物Oldenlandia affinis中鉴定的OaAEP1b可将前体肽C端切割与主链环化偶联，但无法切割环肽前体的N端。类似地，CeAEP1通过C端切割偶联大环化反应，经分子内转肽生成SFTI-1。有趣的是，MCoAEP2可同时介导环肽前体的N端剪切与C端环化。而属于蛋白酶S9家族的SvPCY1则通过水解切割肽底物C端生成大环产物。本研究中，PhPCY3残基与前体肽PreCPs C端跟随肽的氢键相互作用被明确。

在segetalin A生物合成中，SvPCY1通过催化三联体氨基酸（Ser562、Asp653、His695）与底物C端跟随肽形成氢键发挥关键作用。SvPCY1识别与催化分子机制的解析拓展了该酶的底物范围。本研究发现，尽管PhPCY1/2/3与SvPCY1的三联体氨基酸高度保守，但PhPCY1/2不具备催化活性。通过PhPCY3与PhPCY1/2的序列比对及分子对接，证实脯氨酰寡肽酶结构域中N500与S502位点通过氢键相互作用影响催化活性。然而，突变实验显示这两个位点的修饰仅降低酶活而非完全消除，其中PhPCY3 Ser502突变表型与SvPCY1 Ser493突变效应一致。这表明植物间环化机制并不完全保守，石竹科与芸香科orbitides可能需要不同蛋白酶类群参与新型环化机制的解析。尽管PhPCY3在孩儿参环肽发现中表现优异，其是否适用于其他物种orbitides挖掘仍需进一步验证。

核糖体肽（RIPP）环肽是化学与结构多样性的重要来源，而大环肽在过去十年已成为药物开发的优质靶标。富含二硫键的环肽在药物研发中备受关注，基于酵母的体外AEP生物合成体系已被成功开发。本研究建立的植物瞬时表达平台通过挖掘转录组数据实现新型orbitides的发现与合成。未来可利用开源线虫行为分析平台筛选新型环肽的抗线虫活性。这项工作为挖掘不同起源与结构的植物环肽提供了新策略，并为阐明植物环肽环化机制建立了可行平台。

文章来源：

Xianjin Qin, Fengjiao Wang, Dejin Xie, Qi Zhou, Sheng Lin, Wenxiong Lin, Wei Li.Identification of a key peptide cyclase for novel cyclic peptide discovery in Pseudostellaria heterophylla.Plant Commun. 2025 Mar 12:101315.

 doi: 10.1016/j.xplc.2025.101315. Online ahead of print.

*免责声明：本文转自第三方平台，版权归原作者所有，仅供信息传播与参考，不代表本平台的观点和立场。如有异议请及时联系我们删除处理，联系邮箱lighter@medical-lighter.com