单细胞RNA测序揭示免疫微环境重塑  

αPD-1-(iRGD)₂治疗后，肿瘤浸润CD8⁺ T细胞中干性与记忆相关基因（Tcf7、Il7r、Lef1、Bach2）上调（图7D），同时效应基因（Gzma、Ifng）中度表达，而耗竭标志物（Pdcd1、Lag3）低表达，提示“更优效应”T细胞扩增（图7）。髓系细胞中，树突状细胞（DCs）的抗原呈递功能增强（图S6A-S6D），巨噬细胞对免疫刺激的反应提升（图S6E-S6H）。

图6. αPD-1-(iRGD)₂重塑肿瘤免疫微环境  

(A) MFC模型治疗方案。  

(B) CD45⁺肿瘤浸润免疫细胞的UMAP可视化。  

(C) 各免疫亚群比例。  

(D-F) NK细胞(D)、CD4⁺ T细胞(E)、CD8⁺ T细胞(F)关键基因表达热图。

图7. αPD-1-(iRGD)₂扩增“更优效应”CD8⁺ TILs  

(A) CD3⁺ TILs的UMAP可视化。  

(B) T细胞亚群比例。  

(C) CD8⁺ TILs关键基因表达热图。  

(D) 各T细胞亚群代表性基因表达水平。  

讨论  

双特异性T细胞衔接器（BiTEs）因其衔接效应成为新兴且前景广阔的癌症免疫疗法。然而，当前基于抗CD3的BiTEs存在诸多缺陷，包括招募免疫抑制性CD3⁺ T细胞群、引发全身性细胞因子风暴的风险、免疫检查点分子上调、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、肿瘤抗原丢失或逃逸以及疗效不足。由于几乎所有T细胞均表达CD3，基于抗CD3的BiTEs可能广泛激活T细胞；而基于PD-1抗体的BiTEs可特异性靶向并重定向肿瘤特异性CD8⁺肿瘤浸润T细胞（TILs），这类细胞高表达PD-1且功能暂时受损。因此，本研究选择αPD-1作为修饰对象，发现αPD-1-(iRGD)₂主要作用于PD-1⁺ TILs，避免非选择性T细胞激活及过度TCR信号传导。即使排除渗透相关因素，αPD-1-(iRGD)₂仍显著增强T细胞毒性。竞争性抑制剂（游离iRGD、抗NRP-1和αPD-1）可部分阻断其介导的细胞偶联、肿瘤杀伤及T细胞激活。即使将αPD-1-(iRGD)₂剂量降至0.1 mg/kg并减少给药频率，其仍能扩增肿瘤特异性CD8⁺ T细胞亚群并实现持续肿瘤控制，且不抑制CD8⁺ T细胞的PD-1表达，表明该缀合物通过iRGD渗透至肿瘤核心后，主要介导肿瘤细胞与T细胞的偶联，而非单纯阻断PD-1。

已有研究报道了其他基于αPD-1的BiTEs，主要靶向HER2、VEGF等。这些双特异性抗体均采用IgG1 Fc结构域，提示抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是其抗肿瘤效应的重要机制。相比之下，本研究的缀合物Fc效应较弱，减少了对肿瘤特异性T细胞的潜在耗竭风险。此外，不同于其他通过抗体片段设计靶向肿瘤的双特异性抗体（部分无需TCR-pMHC相互作用即可介导肿瘤杀伤），αPD-1-(iRGD)₂对肿瘤细胞的亲和力较弱，仍依赖TCR-pMHC复合物相互作用启动后续细胞毒性，这一结构差异是其肿瘤特异性T细胞激活特性的基础。

近期，基于αPD-1与CLEC9A的树突状细胞-T细胞衔接器（BiCE）也被报道，其通过消除Fc功能以增强抗肿瘤免疫所需的细胞回路。与传统BiTEs不同，BiCE侧重于免疫细胞间互作，更贴近免疫治疗理念。基于不同设计思路，αPD-1衍生物已成为治疗探索的新方向。

与通过质粒构建表达的单链抗体片段（scFv）型抗CD3-iRGD不同，本研究通过糖工程学平台对人源及鼠源αPD-1进行位点特异性修饰，保留抗体的天然特性，具有以下优势：① 分子量较大且通过FcRn介导循环，αPD-1-(iRGD)₂的半衰期长于scFvs；② 更易纯化且溶解性与稳定性更佳；③ 实体瘤致密微环境限制BiTEs的临床获益，而iRGD偶联可依次结合整合素αvβ5和NRP-1，促进药物向肿瘤深部渗透。一项开放标签、多中心I期临床试验（NCT03517176）中，iRGD联合化疗在转移性胰腺导管腺癌中初步显示出更优疗效。团队前期研究亦证实，iRGD修饰可增强T细胞渗透及抗肿瘤活性。此外，肿瘤内预存的T细胞状态是影响BiTEs疗效的关键因素，本研究表明αPD-1-(iRGD)₂的疗效主要由肿瘤内特异性CD8⁺ T细胞驱动。

值得注意的是，游离iRGD（2.5 μg）联合αPD-1组未表现出优于αPD-1单药的抗肿瘤效果。与Sugahara等人的研究（iRGD剂量4 μmol/kg时，偶联与游离iRGD疗效相当）不同，本结果可能因游离iRGD半衰期仅数分钟，需频繁给药，且无法介导T细胞-肿瘤细胞偶联。而αPD-1-(iRGD)₂即使低剂量仍有效，且不抑制CD8⁺ T细胞的PD-1表达，同时显著扩增肿瘤特异性T细胞亚群（CD39⁺PD-1⁺）。推测其通过聚集肿瘤细胞与T细胞促进TCR-pMHC互作，激活肿瘤特异性T细胞。iRGD偶联形成的BiTE样机制显著降低iRGD需求剂量并延长给药间隔，提升治疗依从性。

最后，αPD-1-(iRGD)₂可增强CD8⁺ T细胞功能并扩增“更优效应”PD-1⁺TCF-1⁺CD8⁺ T细胞。这类细胞在慢性感染与肿瘤免疫应答中至关重要，其丰度是免疫治疗成功的关键。单细胞RNA测序显示，αPD-1-(iRGD)₂治疗后，肿瘤浸润CD8⁺ T细胞中干性与记忆相关基因（如Tcf7、Il7r）、中度效应基因（如Gzma、Ifng）及低耗竭标志物（如Pdcd1、Lag3）显著上调。iRGD受体（整合素αv与NRP-1）可能通过调控CD8⁺ T细胞免疫参与PD-1阻断疗效，具体机制有待进一步探索。

肿瘤特异性TILs的丰度及iRGD受体表达水平或为αPD-1-(iRGD)₂应用的潜在标志物。然而，其在低免疫浸润的“冷肿瘤”（如B16F10和4T1模型）中仍有效。此外，炎症与伤口愈合等非恶性状态也可上调肿瘤靶向分子，需进一步安全性评估。iRGD联合化疗的I期临床研究显示，其主要3-4级不良事件（中性粒细胞减少、贫血等）与化疗组相似，但需更大样本验证。

过去十年，以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗已重塑多种肿瘤的标准治疗。然而，药物摄取不足与免疫浸润不佳限制了临床获益。本研究通过糖工程学平台对人源及鼠源αPD-1进行位点特异性修饰，证实αPD-1-(iRGD)₂通过同时靶向T细胞与肿瘤细胞、促进肿瘤特异性T细胞扩增及“更优效应”T细胞群形成，显著提升疗效。该策略为抗PD-1治疗提供了新范式，并有望通过独特机制重塑TME，拓宽抗体偶联药物的临床应用场景。

文章来源：

Yunfeng Pan, Qi Xue, Yi Yang, et al.Glycoengineering-based anti-PD-1-iRGD peptide conjugate boosts antitumor efficacy through T cell engagement.Cell Rep Med. 2024 Jun 18;5(6):101590.

 doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101590. Epub 2024 Jun 5.

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