尽管近年来免疫检查点抑制剂取得了重要突破，但客观缓解率仍有限。本研究通过糖工程学方法合成了程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）抗体-iRGD环肽缀合物（αPD-1-(iRGD)₂）。该缀合物不仅能增强组织渗透性，还可通过双重靶向同时结合肿瘤细胞和PD-1⁺ T细胞，从而介导肿瘤特异性T细胞的激活与增殖，且对非特异性T细胞影响较小。在多种同源小鼠模型中，αPD-1-(iRGD)₂有效抑制肿瘤生长并表现出良好的生物安全性。流式细胞术和单细胞RNA测序结果显示，αPD-1-(iRGD)₂可重塑肿瘤微环境，并扩增一类表达干性与记忆相关基因（如Tcf7、Il7r、Lef1和Bach2）的“更优效应”CD8⁺肿瘤浸润T细胞。综上，αPD-1-(iRGD)₂是一种超越抗体-药物偶联物的新型癌症免疫治疗候选药物。

引言  

以免疫检查点抑制剂（ICIs）为代表的癌症免疫疗法近年来显著改善了晚期癌症患者的生存。尽管ICI的适应症逐步扩展，但其在多种实体瘤中的客观缓解率（ORR）仍仅为10%-30%，这促使研究者开发更具疗效的新型ICI。双特异性T细胞衔接器（BiTEs）是一种新兴的免疫疗法，因其可同时靶向T细胞和肿瘤细胞，BiTEs能以更低剂量介导有效的肿瘤控制。然而，传统BiTEs通过结合CD3激活T细胞，绕过了T细胞受体（TCR）与肽-主要组织相容性复合体（pMHC）的相互作用，可能导致非选择性T细胞激活和严重副作用。鉴于PD-1⁺ T细胞主要具有肿瘤特异性，本研究尝试基于PD-1抗体设计新型BiTEs，将传统BiTEs的广泛T细胞激活转化为肿瘤特异性模式。

但类似CAR-T疗法，BiTEs在实体瘤中的疗效仍面临挑战，主要障碍是实体瘤致密微环境导致的渗透困难。目前临床使用的PD-1/PD-L1抗体分子量约150 kDa，限制了其在肿瘤内的分布。研究表明，抗体在肿瘤内需5-7天达到峰值浓度，且仅能渗透至血管周围区域（约占肿瘤体积的35%）。小样本临床试验提示，PD-1抗体的局部摄取量与临床反应正相关，而PD-L1表达水平无关，表明提升渗透性是优化PD-1抗体及BiTEs疗效的潜在策略。

本研究选用基石药业（苏州）开发的CS1003抗体（对人和小鼠PD-1的Kd分别为6.13×10⁻⁹ M和3.99×10⁻⁹ M），其结合表位与帕博利珠单抗、纳武利尤单抗不同，且在MC38-hPD-L1模型中表现出与纳武利尤单抗相当的抗肿瘤效果。此外，引入内化RGD肽（iRGD），其通过结合肿瘤血管的αv整合素促进外渗，经蛋白酶切割后暴露CendR基序（CRGDK），与神经纤毛蛋白-1（NRP-1）相互作用激活跨细胞作用，增强肿瘤深部渗透。团队前期研究证实，iRGD修饰可增强T细胞穿透与抗肿瘤活性。然而，传统方法难以实现iRGD与天然双链抗体的高效偶联。为此，本研究采用糖工程学技术（LacNAc偶联平台），通过Fc结构域糖基化位点实现iRGD与αPD-1的特异性偶联，肽-抗体比接近2:1。

结果  

αPD-1-(iRGD)₂的合成与表征

通过糖工程学与生物正交反应合成αPD-1-(iRGD)₂（图1A）。电喷雾电离质谱（ESI-MS）显示其分子量为148,833.00 Da（图1C）。ELISA验证其对人/小鼠PD-1的结合亲和力与未修饰αPD-1无显著差异（Kd分别为1.918×10⁻⁸ nM和2.65×10⁻⁸ nM）（图1D, 1E）。细胞实验表明，αPD-1-(iRGD)₂对PD-1⁺ Jurkat细胞的EC₅₀为0.04 μg/mL（αPD-1为0.06 μg/mL）（图1F）。药代动力学显示其半衰期与未修饰αPD-1相似（>7天）（图S1F-S1H）。肿瘤细胞（如HGC27、B16F10）高表达iRGD受体（整合素αvβ5和NRP-1），而正常细胞（如293T）几乎不表达（图S1I-S1L）。竞争性抑制实验证实αPD-1-(iRGD)₂的亲和力依赖上述受体（图S1N, S1O），且对正常组织无显著结合（图1K）。

图1. αPD-1-(iRGD)₂的合成与表征  

(A) αPD-1-(iRGD)₂的结构及化学合成流程图。  

(B) 核心底物GDP-岩藻糖-iRGD的制备。  

(C) αPD-1-(iRGD)₂的ESI-MS表征。  

(D, E) ELISA检测αPD-1-(iRGD)₂与未修饰抗体对人源(D)及鼠源(E) PD-1蛋白的结合亲和力。

αPD-1-(iRGD)₂介导T细胞与肿瘤细胞的双重靶向  

αPD-1-(iRGD)₂通过结合PD-1与iRGD受体，形成T细胞-肿瘤细胞偶联（图2A）。在B16-OVA与OT-I细胞共培养体系中，αPD-1-(iRGD)₂显著促进细胞偶联（图2B, 2C），该效应可被iRGD、抗整合素αvβ5或抗NRP-1竞争性抑制（图S2C）。在单层与多细胞球体（MCS）模型中，αPD-1-(iRGD)₂浓度依赖性增强OT-I细胞对B16-OVA的杀伤（图2D, 2E），并激活T细胞表达CD69、CD25、GZMB和IFNγ（图2G-2I）。PD-L1在肿瘤细胞中低表达（图S2D, S2E），提示BiTE样效应是疗效增强的关键。

图2. αPD-1-(iRGD)₂介导肿瘤细胞与T细胞的偶联

(A) αPD-1-(iRGD)₂偶联肿瘤细胞与T细胞的示意图。  

(B) B16-OVA细胞与OT-I细胞（E:T=1:10）共培养后CFSE/Dye670双阳性细胞比例。  

(C) (B)的流式细胞术代表性结果。  

(D) 单层B16-OVA细胞与OT-I细胞共培养的裂解率（抗体浓度梯度）。  

(E) B16-OVA多细胞球体（MCS）与OT-I细胞共培养的裂解率（抗体浓度梯度）。

αPD-1-(iRGD)₂的肿瘤渗透与分布

在HGC27 MCS模型中，αPD-1-(iRGD)₂-Cy5快速渗透至球体核心（图3B, 3C）。小鼠胃癌模型活体成像显示，αPD-1-(iRGD)₂-Cy5在肿瘤内快速富集（图3D, 3E），48小时后肿瘤荧光强度较αPD-1-Cy5提升一倍（图3F, 3G），且器官摄取无显著增加（图3H）。

图3. αPD-1-(iRGD)₂在肿瘤内的靶向分布与渗透

(A) Cy5标记αPD-1-(iRGD)₂的渗透实验设计。  

(B) 共聚焦显微镜显示Cy5标记抗体在MCS中的渗透（×50，标尺200 μm）。  

(C) MCS内荧光强度随时间变化。  

(D) MFC荷瘤小鼠肿瘤部位平均辐射效率（Cy5标记抗体腹腔注射）。  

(E) 腹腔注射后不同时间点活体荧光成像。  

(F) 注射48小时后离体肿瘤及主要器官荧光成像。  

(G) 肿瘤离体平均辐射效率。  

(H) 肿瘤切片免疫荧光分析（αPD-1-FITC，CD8⁺ T细胞-PE，核染色蓝色；×20，标尺200 μm）。

αPD-1-(iRGD)₂的体内抗肿瘤效果

在MFC、B16F10和4T1模型中，αPD-1-(iRGD)₂显著延缓肿瘤生长并延长生存期（图4A-4G, S3A-S3F）。流式分析显示，αPD-1-(iRGD)₂组肿瘤微环境中CD8⁺ T细胞显著增加（图4H-4J），且IFNγ表达上调（图4L）。低剂量（0.1 mg/kg）αPD-1-(iRGD)₂仍有效抑制肿瘤，而αPD-1单药无效（图5G-5I）。CD8⁺ T细胞耗竭或迁移抑制实验证实其疗效依赖肿瘤内预存T细胞（图5A-5F）。

图4. αPD-1-(iRGD)₂的体内抗肿瘤疗效

(A) MFC胃癌模型治疗方案。  

(B, C) 肿瘤生长曲线(B)及终点瘤重(C)。  

(D) B16F10黑色素瘤模型治疗方案。  

(E, F) 肿瘤生长曲线(E)及终点瘤重(F)。  

(G) MFC模型生存曲线。

图5. αPD-1-(iRGD)₂疗效依赖肿瘤内预存CD8⁺ T细胞

(A) T细胞迁移抑制实验设计。  

(B) 外周血T细胞丰度验证FTY720的迁移抑制效果。  

(C) 肿瘤生长曲线。  

(D) CD8⁺ T细胞耗竭实验设计。  

(E) 肿瘤内CD8⁺ T细胞丰度验证耗竭效果。  

(F) 肿瘤生长曲线。  

(G) 低剂量治疗方案设计。  

(H) 终点瘤重。  

(I) 肿瘤生长曲线。  

(J-M) 肿瘤内CD8⁺ T细胞、PD-1、CD39、CD4⁺ T细胞及Treg丰度分析。  

(O) GP33/SIINFEKL肽预载肿瘤细胞与OT-I细胞共培养的杀伤分析。  

(P) OT-I细胞与脾脏T细胞激活标记（CD25、CD69）表达。  

(Q-T) 1G4-PD-1-Jurkat与PD-1-Jurkat细胞偶联及CD69表达分析。

文章来源：

Yunfeng Pan, Qi Xue, Yi Yang, et al.Glycoengineering-based anti-PD-1-iRGD peptide conjugate boosts antitumor efficacy through T cell engagement.Cell Rep Med. 2024 Jun 18;5(6):101590.

 doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101590. Epub 2024 Jun 5.

*免责声明：本文转自第三方平台，版权归原作者所有，仅供信息传播与参考，不代表本平台的观点和立场。如有异议请及时联系我们删除处理，联系邮箱lighter@medical-lighter.com