肠道法尼醇X受体（FXR）拮抗剂已被证实可有效改善代谢性疾病，尤其是代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）。现有FXR拮抗剂均靶向受体配体结合口袋（LBP），而靶向核受体（NR）非LBP位点的拮抗剂被认为是开发新型FXR拮抗剂的潜力策略。本文基于“阻断FXR与共激活剂相互作用”的假说，成功开发出一系列大环肽类FXR拮抗剂。其中，环肽DC646不仅表现出强效FXR抑制活性，且对其他NR具有高度选择性。通过肠道FXR依赖机制，DC646展现出显著治疗MASH的潜力及良好的安全性。不同于已知FXR拮抗剂，DC646特异性结合FXR的共激活剂结合位点，阻断共激活剂募集，减少肠源性神经酰胺向肝脏的循环，并促进胰高血糖素样肽-1（GLP-1）释放。本研究首次发现靶向FXR-共激活剂相互作用的环肽，为FXR拮抗剂治疗MASH开辟新路径。

引言  

FXR是由胆汁酸激活的核受体，对胆汁酸及固醇代谢调控至关重要。肠道FXR拮抗策略因可改善代谢紊乱而备受关注。核受体家族具有保守模块结构：N端非配体激活域、DNA结合域（DBD）、铰链区及含LBP、AF2位点、BF3位点的配体结合域（LBD）。其中，由α3、α4及α12残基形成的AF2疏水沟槽对共激活剂（如类固醇受体共激活剂SRC）的募集至关重要，其介导NR的N端与C端分子内互作。尽管NR间AF2位点序列高度相似，但其表面形状及静电特性差异为NR特异性拮抗剂设计提供可能。例如，雄激素受体（AR）AF2形成深疏水沟槽，促使多个靶向该位点的AR拮抗剂被发现；而FXR的AF2呈浅阔疏水口袋，导致靶向该位点的小分子开发困难。目前所有报道的FXR激动剂及拮抗剂均结合FXR-LBD，尚未发现通过阻断LBD与共激活剂间蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）发挥功能的FXR拮抗剂。

次级胆汁酸（如牛磺-β-鼠胆酸T-β-MCA[1]、甘氨熊去氧胆酸GUDCA[2,10]及猪胆酸HCA）被鉴定为内源性FXR拮抗剂，通过抑制肠道FXR信号改善肥胖小鼠代谢终点。这些靶向LBD-LBP位点的传统FXR拮抗剂通过阻断初级胆汁酸结合间接破坏FXR与共激活剂互作，但存在拮抗活性弱、难以实现肠道特异性暴露等局限。系统性暴露可能抑制肝脏FXR，导致胆汁淤积或肝细胞癌（HCC），而肝脏FXR拮抗与肝损伤相关。因此，亟需开发直接阻断FXR-共激活剂互作的新型肠道靶向FXR拮抗剂。

环肽兼具小分子与蛋白质特性，是调控PPIs的理想工具，在代谢调控及肠道菌群调节中展现潜力。相较于线性肽，环肽具有更强的靶标结合力、选择性、脂溶性及蛋白酶抗性，更易实现肠道靶向。本研究通过AlphaScreen筛选内部环肽库，发现含C4吗啉修饰色氨酸的环肽DC646，其有效阻断FXR-LBD疏水沟槽对共激活剂的募集，显著抑制FXR转录活性，并对其他NR具有高选择性。机制上，DC646直接干扰关键PPIs，减少肠源性神经酰胺向肝脏转运并促进GLP-1释放，从而缓解MASH症状。DC646的发现丰富了FXR配体库，并为靶向代谢及肝病提供新思路。

结果  

环肽DC646作为新型FXR拮抗剂的设计与发现  

已知FXR激动剂/拮抗剂均结合FXR-LBD（图1a）。本研究通过阻断LBD与共激活剂间PPIs筛选抑制剂（图1b）。基于环肽调控PPIs的优势，筛选内部环肽库发现含C4吗啉修饰色氨酸的环肽DC644具有FXR拮抗活性（图1c-f）。分子对接显示DC644占据FXR-LBD共激活剂结合位点（图1g）。进一步优化环肽骨架，设计合成DC645-DC649（图2a），其中DC646在报告基因实验及AlphaScreen检测中表现最强拮抗活性（IC50=8.86 μM），且无激动效应（图2b-f）。

图1 环肽作为FXR拮抗剂的发现  

(a) FXR-LBD与激动剂（CDCA、GW4064）、拮抗剂（伊维菌素）及共激活剂的复合物结构（PDB:3DCT、4WVD、6HL1）。  

(b) FXR共激活剂及AF2位点界面。  

(c) 环肽库筛选策略。  

(d) AlphaScreen检测示意图。  

(e) AlphaScreen实验设计。  

(f) 环肽DC644在CDCA存在下抑制SRC2-3募集（n=3）。  

(g) DC644与FXR-LBD的分子对接模型（PDB:4WVD）。 

图2 环肽DC646作为强效FXR拮抗剂  

(a) DC645-DC649的理性设计。  

(b) DC646在GW4064存在下抑制FXR转录活性（n=3）。  

(c) AlphaScreen实验设计。  

(d-e) CDCA及DC646单独对SRC2-3募集的EC50。  

(f) DC646在CDCA存在下的IC50（n=3）。  

DC646通过结合共激活剂位点发挥FXR拮抗作用  

X射线晶体分析确定DC646结构。AlphaScreen检测显示，DC646竞争性阻断伊维菌素诱导的hFXRα-LBD与共激活剂SRC2-3及辅阻遏物NcoR2的互作（图3a-e）。分子对接及点突变实验（Q296A/K303A）证实DC646结合FXR-LBD共激活剂结合口袋，通过氢键与Q296/K303互作（图3f-g）。添加顺序实验表明DC646通过占据FXR-LBD表面抑制共激活剂结合（图4a-b）。免疫共沉淀验证DC646与FXR-LBD直接结合，且与CDCA结合位点不同（图4c-e）。

图3 DC646通过Q296/K303介导FXR拮抗  

(a) AlphaScreen实验设计。  

(b-c) 伊维菌素诱导SRC2-3/NcoR2募集的EC50。  

(d-e) DC646竞争性抑制伊维菌素效应（n=3）。  

(f) DC646与FXR-LBD的分子对接模型。  

(g) Q296/K303突变削弱DC646拮抗活性（n=3）。  

图4 DC646的新型拮抗机制  

(a) AlphaScreen实验设计。  

(b) 不同添加顺序下DC646的IC50。  

(c-e) 免疫共沉淀验证DC646结合位点及PPI抑制机制。 

DC646通过肠道FXR拮抗缓解MASH病理  

肠道类器官实验显示DC646以FXR依赖方式逆转GW4064诱导的Shp表达（图5a-c）。MCD饮食诱导的MASH小鼠模型中，DC646选择性抑制肠道FXR信号，显著降低血清ALT、肝TG及脂滴沉积，改善炎症与纤维化，效果优于GUDCA及OCA（图5d-o）。Fxr敲除及Fxr△IE小鼠实验证实DC646疗效依赖于肠道FXR（图6a-e）。机制上，DC646抑制肠神经酰胺合成并提升血清GLP-1水平。亚急性毒性实验显示DC646安全性良好，耐受剂量超最低有效剂量20倍。

图5 DC646缓解MCD诱导的MASH病理  

(a) 动物实验设计。  

(b-c) DC646选择性抑制肠道FXR信号（n=5）。  

(d) MASH模型治疗策略。  

(e-f) DC646对肠道/肝脏FXR信号的影响。  

(g-h) 血清ALT及肝TG水平。  

(i-k) 肝组织染色及定量。  

(l-o) 脂代谢、炎症及纤维化相关基因表达（n=6-7）。

图6 DC646疗效依赖FXR

(a) Fxr敲除小鼠实验设计。  

(b) 肠道FXR靶基因表达（n=4-6）。  

(c-e) ALT、肝组织病理及NAS评分（n=6）。  

(f) 作用机制总结（BioRender绘制）。  

讨论  

FXR调控多种生理病理过程，其配体在疾病治疗中潜力显著。尽管FXR激动剂进入MASH临床试验，但血脂异常及瘙痒等问题限制其应用。肠道靶向FXR拮抗剂通过抑制肠源性神经酰胺合成及增强GLP-1释放改善代谢紊乱，但现有拮抗剂均靶向LBP，间接调控FXR活性。本研究首次发现直接靶向FXR-共激活剂互作的环肽拮抗剂DC646，其通过占据AF2位点阻断共激活剂/辅阻遏物募集，选择性抑制肠道FXR，缓解MASH病理。DC646的发现不仅为MASH治疗提供新策略，亦揭示FXR拮抗剂的新结合口袋。

本研究开发出首个靶向FXR-共激活剂互作的肠道选择性环肽拮抗剂DC646，其通过抑制肠源性神经酰胺及增强GLP-1释放缓解MASH，兼具高效性与安全性，为代谢及肝病治疗提供新范式。

文章来源：

Yazhou Li , Tingying Jiao , Xi Cheng,et al.Development of cyclopeptide inhibitors specifically disrupting FXR-coactivator interaction in the intestine as a novel therapeutic strategy for MASH.Life Metabolism.2025 Feb 8. 

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