蛋白质聚集体与许多疾病有关。在这里，本篇文章作者报道了一个基于噬菌体辅助 连续进化（PACE），从大肠杆菌中基因编码的环肽文库中快速表型选择蛋白质聚集抑制剂的平台。作者开发了一种新的PACE兼容选择，用于蛋白质聚集抑制，并使用它来鉴定抑制淀粉样蛋白Aβ42和人胰岛淀粉样蛋白hIAPP的环肽。此外，作者还整合了阴性选择，可去除假阳性和脱靶效应，大大提高了环肽选择性。以上表明，在体外测定中化学再合成时，选定的抑制剂具有活性。作者开发的平台为快速发现蛋白质聚集的环肽抑制剂提供了一种强大的方法，并可能作为具有广谱抑制活性的环肽未来进化的基础。

研究背景

淀粉样蛋白的聚集与许多人类疾病有关。这些蛋白质通过一系列错误折叠的中间体，最终形成有序的纤维状结构，称为淀粉样蛋白，从而激发了人们寻找可以破坏其形成的化合物。然而，由于许多淀粉样蛋白的固有无序性质以及淀粉样蛋白前体结构信息的缺乏，蛋白质错误折叠和聚集抑制剂的结构引导设计变得复杂。

通过高通量筛选或选择发现抑制剂通常需要最少的结构信息，为理性设计提供了强大的替代方案。最近一个令人兴奋的例子是使用纯化蛋白筛选小分子文库对体外淀粉样蛋白形成动力学的影响。此类筛选已经确定了有前途的潜在客户。但尽管如此，它可能会受到通量和生产高质量靶蛋白的技术挑战的限制，以确保可重复性。此外，小分子可能不适合与无序的错误折叠物种紧密结合或强烈抑制错误折叠和聚集所涉及的蛋白质-蛋白质相互作用。

大环肽已日益被认为是化学探针和潜在疗法的有前途的来源。这些化合物可以结合历史上具有挑战性的靶标，例如大或浅的蛋白质表面，并且由于骨架刚性化而具有更高的稳定性和结合效力。选择基因编码的环肽文库的平台可以在大量序列中搜索具有所需生物活性的序列。例如，mRNA和噬菌体展示方法已被证明在识别众多靶标的大环抑制剂方面非常成功。然而，展示技术通常仅限于识别固定化蛋白质的结合物。由迅速崛起的合成生物学领域实现的互补方法涉及细胞中核糖体合成的环肽文库的遗传或表型。值得注意的是，该策略可以识别具有超越单靶标结合活性的环肽，包括抑制蛋白质聚集。在一个开创性的例子中，Lindquist小组通过选择使用肽和蛋白质的分裂-内含肽环连接（SICLOPPS）方法生物合成的环肽，确定了α-突触核蛋白聚集诱导毒性的抑制剂，在酵母突触核蛋白病模型中。最近，Skretas小组使用荧光激活细胞分选来选择SICLOPPS文库，以挽救大肠杆菌中的GFP折叠报告基因，以鉴定淀粉样蛋白β（Aβ）和突变超氧化物歧化酶聚集的环肽抑制剂。

这些用于鉴定环肽蛋白聚集抑制剂的策略虽然功能强大，但与细胞存活或基于荧光的分选等常规选择相结合，这些选择既费时又费力，并且在细胞分选的情况下，需要专门的设备。此外，选区可能会出现误报或发现具有不良属性，例如混杂或脱靶活动。例如，Lindquist研究中选择的大多数命中被认为是假阳性，要么是由于酵母菌株的自发突变引起的，要么是由于环肽本身的脱靶活性引起的。然后，剔除这些假阳性和脱靶序列需要额外的实验，从而增加时间和劳动力。

为了解决这些限制，作者开发了一个基于噬菌体辅助连续进化（PACE）选择环肽蛋白聚集抑制剂的平台。通过将环肽活性与噬菌体繁殖联系起来，作者可以每天进行1-2轮选择，从而仅使用标准分子生物学技术和设备即可快速发现活性序列。作者通过使用它来识别抑制疾病相关蛋白Aβ42和人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）聚集的环肽序列来证明作者系统的实用性。作者还报道了阴性选择的实施，该筛选清除了具有脱靶活性的命中，从而产生选择性环肽序列。最后，作者表明作者鉴定的hIAPP抑制剂在体外淀粉样蛋白形成测定中具有活性。作者设想所报道的系统将提高细胞环肽选择的速度和便利性，并补充现有识别疾病相关蛋白聚集抑制剂的策略。

研究结果

PACE和PACE相关技术使用携带所选目标基因

（GOI）的工程化M13噬菌体（选择噬菌体（SP））代替噬菌体基因III（gIII）。gIII编码蛋白III（pIII），该蛋白对于大肠杆菌宿主细胞的感染和病毒逃逸都是必不可少的。在宿主细胞中的“辅助质粒”上进行的遗传选择提供了响应某些研究人员定义的活性的pIII，将噬菌体繁殖与获得所需性状的GOI选择联系起来。最后，可选地包含诱变质粒可实现GOI的连续多样化。PACE及其相关技术与传统的定向进化方法的不同之处在于，它们能够探索大型文库并大大加快选择时间。非连续变体，例如PANCE（噬菌体辅助非连续进化）和PANCS（噬菌体辅助非连续选择），无需专门的连续流设备即可进行快速筛选，并且可供任何具有基本分子生物学基础设施的实验室使用。

PACE和相关技术已被用于进化多种蛋白质。但是，据我们所知，尚未应用于环肽。在这里，我们设想了噬菌体辅助环肽发现的一般策略，如图1所示。我们从通过标准克隆技术生成的SP编码的环肽文库开始。该SP库用于用辅助质粒感染大肠杆菌宿主细胞，该辅助质粒将所需的环肽活性与pIII表达联系起来。感染后，大肠杆菌生物合成所有SP编码的基因，包括环肽。如果环肽具有所选的活性，它会触发宿主细胞的pIII表达，从而实现噬菌体增殖。因此，只有携带活性环肽的SP才会在群体中富集。

                                                                       图1.基于PAGE的环肽发现策略。

与PACE兼容的蛋白质聚集抑制剂选择

以前在细胞中选择蛋白质错误折叠抑制剂的策略使用了细胞活力或来自荧光蛋白融合的信号。这些方法不能转化为PACE，这需要将所选活性与gIII表达偶联。因此，我们转向分裂T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）报告基因，用于进化具有改善可溶性表达的蛋白质。在我们的选择中，宿主大肠杆菌表达一种易聚集蛋白（APP），该蛋白与分裂T7 RNAP（T7n）的N末端一半融合。当APP-T7n融合被翻译时，它会由于APP而错误折叠，从而阻止T7n与分裂T7RNAP的C端半部分结合（T7c;SP编码的抑制剂结合并阻止APP聚集，融合的T7n将保持折叠并与T7c结合以产生全长T7RNAP。然后，重组的T7RNAP转录gIII，我们将其置于T7启动子的控制之下（PT7），产生pIII并允许SP繁殖。

我们最初将与阿尔茨海默病有关的Aβ42肽作为APP。我们之所以选择，是因为最近发现了一种Aβ42聚集的环肽抑制剂cyclo-CKVWQLL，这将为优化和基准测试我们的系统提供有价值的控制。当与T7n融合时，Aβ42应迅速聚集并防止T7 RNAP重建。因此，这种融合因P T7产生低gIII转录和携带对照基因的SP（kanR）在宿主细胞上繁殖不佳。进一步比较，我们测试了非聚集性Aβ42突变体（F19S;L34P），这导致kanR SP复制增加了~500倍。结果表明，分裂的T7 RNAP折叠报告基因可以将Aβ42聚集的程度转化为gIII转录的变化。

                                                           图2.环肽蛋白聚集抑制剂的选择设计。

SP 编码的 SICLOPPS 环肽的选择

接下来，我们确定我们的选择是否可以区分编码抑制 Aβ42 聚集的环肽的 SP 和携带无活性环肽的 SP。我们使用 SICLOPPS 方法生物合成可在大肠杆菌中选择的环肽。在 SICLOPPS 中，由 Ssp DnaE 分裂内含肽的 C 端一半、待环化的肽序列和同一分裂内含肽的 N 端一半组成的前体融合在翻译后发生内含肽剪接，以产生头到尾的环化肽。为了对我们的系统进行基准测试，我们使用了从 SICLOPPS 环肽库中鉴定的阳性对照序列 cyclo-CKVWQLL，以抑制细胞内 Aβ42-GFP 聚集，并且在体外和秀丽隐杆线虫 Aβ42 聚集模型中化学再合成时显示具有活性。

我们测量了携带 SICLOPPS 前体的 SP 在编码 Aβ42-T7n 选择的大肠杆菌上的环 CKVWQLL 或加扰对照环 CVQWLKL 的繁殖。与携带加扰对照的 SP 相比，CKVWQLL SP 的增殖显著增加（~500 倍）。然而，我们担心观察到的低噬菌体总扩增（0.01-10 倍）可能会妨碍从文库中选择活性环肽。我们认为环肽成熟速度可能不够快，无法在 SP 生命周期 （~15 min） 期间触发 pIII 产生。或者，可能需要 SP 骨架优化来协调噬菌体生命周期与我们的选择，这在之前已经观察到，并且可以为实施新的 PACE 选择提供先决条件。为了提高环肽编码噬菌体的整体适应性，我们在 PACE 中的 Aβ42-T7n 选择细胞上进化了亲本 CKVWQLL SP。我们选择了 SP 克隆 2用于下游实验。与亲本相比，这种进化的 SP 表现出显着增加的总体增殖。但在 CKVWQLL 和加扰对照之间保持了出色的（~300 倍）区分度。在对 CKVWQLL 活性很重要的残基处安装点替换导致 SP 繁殖减少，进一步支持噬菌体适应性对环肽序列的依赖性。

SICLOPPS 的环肽形成是通过内含肽剪接发生的。我们使用 CKVWQLL SP 测试了噬菌体增殖是否具有剪接依赖性，其中 N 末端内含肽中的第一个半胱氨酸被丙氨酸取代，从而阻止了第一个剪接中间体的形成。出乎意料的是，内含肽失活并不影响 CKVWQLL SP 的传播。表明该序列的内含肽结合和成熟环肽形式均具有活性。缺乏剪接依赖性不能用我们进化的 SP 来解释，因为未进化的 SP 也表现出不依赖剪接的活动。此外，它不是我们基于噬菌体的选择的伪影，因为我们在类似于用于识别 CKVWQLL 序列的 Aβ42-GFP 折叠报告基因上测试质粒表达的 SICLOPPS 前体的实验中也观察到了它。这表明，在选择 SICLOPPS 文库时，正在选择的物种可能以预剪接、剪接中间体和剪接产物的混合物形式存在。然而，SICLOPPS 文库反复产生环肽，这些肽在化学重新合成并在正交测定中测试时起作用，这表明这种歧义不会阻止发现活性位点。

接下来，我们测试了我们是否可以通过对 cyclo-CX6 SP 文库进行研究，从随机序列库中选择活性环肽（X = NNK 编码的氨基酸）到 PANCS使用编码 Aβ42-T7n 的宿主细胞。总共 ~3 × 106在七轮中选择转化体，在此期间，我们观察到 SP 池适应性的增加（通过选择细胞上的倍数噬菌体增殖来测量），表明活性环肽序列的富集。深度测序显示，最终的 SP 库已经强烈收敛，顶部序列 （CRVWCAR） 占总测序读数的 ~65%。前 50 个序列的比对，显示与环 CKVWQLL 高度相似，而顶部序列 （CRVWCAR） 与先前研究中鉴定环 CKVWQLL 的选择高度富集的序列（例如，CRVWCAL 和 CRVWQAL）非常相似。   

                                                               图3.环肽Aβ42聚集抑制剂的选择

我们测量了编码前两个序列 CRVWCAR 和 CRVYQVL 的克隆噬菌体在 Aβ42-T7n 选择上的适应性。携带 CRVWCAR 的 SP 表现出稳健的繁殖，与 CKVWQLL SP 相当，而携带 CRVYQVL 的 SP 表现出更适度的适应性。我们还通过丙氨酸取代探测了 CRVWCAR 的序列依赖性。将残基 2-4 替换为丙氨酸大大降低了活性，这与我们的选择在这些位置强烈富集 R、V 和 W 一致。然而，用丙氨酸取代第一个半胱氨酸，防止 SICLOPPS 剪接，对 Aβ42-T7n 抑制没有明显影响。这与我们的观察结果一致，即 CKVWQLL 活性也不依赖于剪接。最后，我们在 Aβ42-GFP 折叠报告基因测定中将我们的序列活性与 CKVWQLL 进行了比较。CRVWCAR 具有与 CKVWQLL 相当的活性，而 CRVYQVL 似乎无活性。然而，CRVYQVL 构建体的诱导大大降低了细胞生长。这可能使 Aβ42-GFP 荧光的拯救变得复杂。

总之，这些结果表明，我们的系统可以从 SP 编码的文库中选择活性环肽序列。

连续诱变的影响

在 PACE 中，诱变质粒（例如 MP6）可以使文库多样化，而不仅仅是最初通过克隆获得的文库。我们通过选择 SP 编码的环 CZ6 SICLOPPS 文库来测试连续诱变的效果（Z = NDT 密码子编码的氨基酸：R、N、D、C、G、H、I、L、F、S、Y 或 V）（~3 × 106总序列）用于 Aβ42-T7n 聚集抑制剂与 MP6。NDT 密码子排除色氨酸，色氨酸在靶向 Aβ42 的 7 聚体环肽中强烈存在。因此，我们想知道 MP6 是否可以发现起始文库中不存在的含色氨酸的序列。四轮选择后的测序显示与类似于 CKVWQLL 的序列收敛。然而，来自 +MP6 池的序列与来自 −MP6 池的序列高度相似。并且我们没有观察到用于克隆起始文库的 NDT 简并密码子集之外的序列富集。因此，MP6 对这种选择的结果影响最小，可能是因为起始文库已经拥有活性序列。

hIAPP聚集抑制剂的筛选

接下来，我们检查了我们的系统是否可以发现其他疾病相关 APP 的抑制剂。我们靶向 hIAPP，它在 2 型糖尿病患者中形成淀粉样蛋白沉积物，据推测会导致 β 细胞功能障碍。为了创建 hIAPP 聚集抑制剂的选择，我们只需克隆 hIAPP 来代替Aβ42。我们使用了 SP 编码的 CZ6 SICLOPPS 文库（Z = NDT 密码子编码的氨基酸：R、N、D、C、G、H、I、L、F、S、Y 或 V）（~3 × 106多样性序列）。选择该密码子集是为了减小理论文库大小并促进文库克隆。库（总计 ~5 × 106转化体）使用更严格的选择克隆在从额外 250 小时的 PACE 中获得的 SP 上。这种转向更高严格度的选择，并相应地，由于 hIAPP-T7n 产生的背景相对于 Aβ42-T7n 增加，因此需要进一步进化的 SP 能够在更高的严格度下执行。

我们进行了五轮筛选，每轮将 SP 池稀释 10 倍。在选择过程中，SP 池适应性略有增加（~35 倍）。为了验证我们选择了活性更高的噬菌体，我们测量了每轮 SP 在 hIAPP 选择细胞上的传播，将输入噬菌体滴度标准化为 105噬菌斑（PFU） /mL，以便进行噬菌体池之间的头对头比较。我们观察到 SP 泳池适应性增加了 ~50 倍，表明选择丰富了活性环肽。对第 5 轮 SP 库的深度测序显示，单个序列 （CHVVGVI） 占测序读数的 ~95%，其中第二丰富的序列 CHVHSYL 与顶部样本表现出一些相似性。除了这两个序列外，我们没有在剩余的富集环肽中观察到任何明显的趋势。

为了进一步研究这种选择的结果，我们比较了编码来自后选择池的 6 个序列和来自起始文库但在后选择池中未检测到的 3 个序列的 SP 的活性。编码后选择序列的所有 6 个 SPs 在 hIAPP-T7n 选择上表现出类似的高适应度。相比之下，来自起始库的 SP 编码序列明显不那么活跃。显性 CHVVGVI 序列的丙氨酸扫描显示，当替代时，没有单个位置会导致 SP 适应性大幅降低。总之，这些结果表明，我们在 hIAPP-T7n 选择上富集了适应性增加的序列，但也表明与 Aβ42-T7n 选择相比，这种选择表现出较低的严格性。

我们合成了环 CHVVGVI 和线性 CHVVGVI，并测量了它们对体外 hIAPP 聚集的影响。环 CHVVGVI 抑制硫黄素 T （ThT） 荧光测定中的 hIAPP 聚集、延迟聚合滞后时间 （t滞后）以剂量依赖性方式（图相比之下，线性 CHVVGVI 抑制 hIAPP 的能力大大降低，表明环化对活动很重要。为了进行比较，我们测试了先前显示可抑制 hIAPP 聚集并降低 hIAPP 对培养细胞的 hIAPP 毒性的 17 聚体环肽39（'MCIP-2a'，以及来自我们起始文库中未被 hIAPP-T7n 选择富集的三种环肽（环-CLDCVFG、环-CHLDIGC 和环-CLSRRCG）。 MCIP-2a 抑制 hIAPP 在较低浓度下与环 CHVVGVI 相当，但在测试的最高化学计量下具有较高的活性。环 CLDCVFG 和环 CHLDIGC 意外降低了总体 ThT 荧光，但对 t 滞后没有明显影响 （ThT 信号的减少似乎并不反映原纤维形成的减少），表明这不是因为这些肽对 hIAPP 聚集的抑制作用。cyclo-CLSRRCG 表现出对 hIAPP 聚集的抑制，尽管没有被我们的选择丰富，因此代表假阴性。

我们进一步表征了环 CHVVGVI 与 hIAPP 的相互作用。透射电子显微镜 （TEM） 分析证实了环 CHVVGVI 延迟 hIAPP 聚集发生的能力，表明当 hIAPP 与环 CHVVGVI 孵育 2 小时时未观察到原纤维。相比之下，在相同条件下单独孵育时，hIAPP 会产生许多原纤维，在孵育较长时间后，当所有 hIAPP 应聚集时，单独由 hIAPP 形成的原纤维或与环肽形成的原纤维之间未观察到形态的明显差异，表明环 CHVVGVI 未掺入 hIAPP 原纤维或以不同形式的聚集体隔离 hIAPP。最后，通过天然质谱 （MS） 分析环 CHVVGVI 与 hIAPP 的相互作用，主要检测到环 CHVVGVI 和 hIAPP 之间的 1：1 复合物，表明环 CHVVGVI 通过与单体 hIAPP 结合来抑制 hIAPP 聚集，这与 APP-T7n 选择机制一致。

这些结果表明，我们的系统可用于快速识别不同 APP 的环肽抑制剂。

                                                           图4. hIAPP聚集的环肽抑制剂的选择

阴性选择识别选择性抑制剂

通过 hIAPP 选择（CHVVGVI 和 CHVHSYL）富集的顶部序列类似于先前鉴定的 Aβ42 聚集抑制剂以及我们自己选择的 Aβ42-T7n 序列。因为 Aβ42 和 hIAPP 的淀粉样蛋白生成区域具有序列相似性，我们想知道我们对 hIAPP 抑制剂的选择是否发现了对 Aβ42 也具有活性的肽。事实上，hIAPP 第 5 轮 SP 池对 hIAPP-T7n 和 Aβ42-T7n 均表现出活性，表明我们识别了混杂序列。然而，SP 池对非淀粉样蛋白生成靶标（一种聚集在大肠杆菌胞质溶胶中的 scFv）无活性。非特异性命中和假阳性是基于选择的环肽发现方法的一个问题。负选择可以提高选择性并消除假阳性，但据我们所知，尚未在细胞环肽选择中进行探索。这些结果促使我们开发了一种负向选择，它可以快速排除具有非选择性活性的环肽，或者在我们的选择电路中在 APP 之外起作用（例如，与 T7n 结合并稳定）。

                                                       图5. 去除混杂环状肽序列的负向选择

为了创建负性选择，我们放置了 gIII-neg在 PT7下面，gIII-neg这是 gIII 的显性负形式。抑制非靶标 APP（例如 Aβ42）会触发 pIII-neg 表达并毒害噬菌体增殖。第二个质粒从噬菌体休击启动子产生少量 pIII。所有感染编码这种阴性选择的细胞的 SP 都获得了足够的 pIII 来繁殖。然而，携带混杂或假阳性环肽的 SP 也产生 pIII-neg 并产生非感染性后代。我们将 hIAPP 第 5 轮噬菌体群体进行四轮负选，每轮将噬菌体稀释 100 倍。hIAPP SP 池在负选择上的起始适应性很低，证实存在对 Aβ42 有活性的文库成员。然而，到第四轮负向选择时，SP 池适应性增加了 ~1,000 倍，表明去除了混杂序列。前阴性和后阴性选择 SP 池的活性比较显示 Aβ42-T7n 聚集抑制降低 ~1,000 倍，而对 hIAPP-T7n 的活性适度降低 （<10 倍）。

后阴性选择池的深度测序显示 CHVVGVI 在前十个序列中不存在。相反，>50% 的测序读数映射到 CDLGVFR 和 CRCVSFG。这些序列没有通过正向选择高度富集，说明了负选择在环肽序列分布中产生较大变化的能力。我们比较了编码 CHVVGVI、CDLGVFR 或 CRCVSFG 的克隆 SP 在编码 hIAPP-T7n 或 Aβ42-T7n 的选择细胞上的活性。虽然 CHVVGVI SPs 在两个靶标上都稳健地繁殖，但 CRCVSFG SP 更具选择性，与 Aβ42 选择细胞相比，在 hIAPP 上的活性高 ~10 倍。编码 CDLGVFR 的 SP 具有显著的选择性，与 Aβ42 相比，在 hIAPP 上的传播能力高 ~1,000 倍。当质粒表达 CHVVGVI、CDLGVFR 和 CRCVSFG 时，我们观察到 Aβ42-GFP 折叠报告基因的类似趋势。这表明选择性不是我们噬菌体系统的产物。

我们检查了化学合成的环 CDLGVFR 和环 CRCVSFG 抑制体外 hIAPP 聚集的能力。两种环肽均抑制 hIAPP 纤化并延长 t滞后。相比之下，线性 CDLGVFR 完全无活性，而线性 CRCVSFG 适度抑制 hIAPP 聚集，但与环 CRCVFSG 相比活性降低。与环 CHVVGVI 一样，环 CDLGVFR 和环 CRCVSFG 在较低浓度下表现出与 MCIP-2a 相似的活性，但在较高肽：hIAPP 化学计量下低于 MCIP-2a。TEM 分析证实，两种环肽都延迟了 hIAPP 聚集并且没有改变 hIAPP 原纤维的整体外观。此外，我们通过天然 MS 观察到环 CDLGVFR 和环 CRCVSFG 与 hIAPP 的 1：1 复合物，这表明与环 CHVVGVI 一样，这些环肽主要是 hIAPP 单体结合物。

                                                        图6. 通过负向选择鉴定的环肽抑制hIAPP聚集

讨论与展望

我们开发了一个用于识别环肽蛋白聚集抑制剂的平台，该平台利用 PACE 的元素来提高选择的速度和便利性。这种方法不需要专门的设备（如细胞分选仪），并且除了初始生成 SP 文库外，无需额外的克隆或转化步骤。为了证明该平台的实用性，我们将其应用于在不到 1 周的时间内鉴定了 hIAPP 聚集的新环肽抑制剂。此外，观察到富集的抑制剂在不同的 APP Aβ42 上也表现出活性，这促使我们创建一种阴性选择策略来去除混杂序列。我们使用这种阴性选择来鉴定选择性抑制 hIAPP 的环肽。脱靶活性或假阳性会困扰活性化合物化学库的选择和高通量筛选，从而导致分离所需结果花费额外的时间和劳动力。因此，此处使用的阴性选择可以通过清除不需要的文库成员来提高苗头化合物质量，并简化所需环肽序列的分离。

此处报道的环肽 hIAPP 抑制剂是通过基于选择的方法鉴定的，而以前，大环肽是通过理性设计生成的，以通过显示的 hIAPP 序列模拟物抑制 hIAPP 聚集或芳香族部分。在头对头比较中，我们的苗头化合物表现出与一种这样合理设计的抑制剂 MCIP-2a 相似的活性，在低肽：hIAPP 化学计量下，但在我们测试的最高浓度下效力较低。我们的环肽与合理设计的抑制剂几乎没有序列相似性，这表明无偏倚的选择可以发现抑制剂开发的新起点。与 MCIP-2a（7 个残基）和其他合理设计的抑制剂（13-18 个残基）相比，它们的尺寸（17 个残基）也明显更小，这是生物利用度的一个优势。未来的努力可能会通过开发需要更多活性环肽才能通过的更严格的选择来提高我们平台鉴定的 hIAPP 抑制剂的效力。

这里出乎意料的观察结果是，来自这项工作和其他研究的 SICLOPPS 环肽序列可能不需要内含肽剪接来抑制靶蛋白聚集。因为剪接效率因 extein 序列而异，很难预测每个环肽文库成员的未剪接产物与剪接产物的比率。因此，所选择的物种可能是肽的内含肽结合和/或剪接形式。我们的 hits 作为化学合成的环肽具有活性，当以线性形式使用时表现出减弱的活性，这表明环构象对于我们选择 hIAPP 抑制剂的活性很重要。然而，其他靶标的行为可能不同，展望未来，可能更优选将 SICLOPPS 中的 Ssp 内含肽与更快的剪接同源物交换，以最大限度地减少以内含肽结合形式进行选择的环肽序列的时间。

我们平台的一个限制是所使用的环肽文库的大小，这受到克隆效率的限制。此约束并非我们的系统所独有，并且适用于其他选择。增加文库大小的一种潜在途径是使用宿主细胞编码的诱变质粒进一步突变 SP。我们检查了用 MP6 选择环肽文库的效果，但未能观察到明确源自 MP6 诱变的富集序列。我们推测这是因为我们的起始库已经包含了在所选目标上具有活动的序列。与通过 MP6 诱变随机发现活性序列的噬菌体相比，编码此类序列的噬菌体在总 SP 池中的比例更高;因此，后者在选拔过程中很可能会被前者击败。这可能不适用于其他靶标，未来的工作可能需要重新审视诱变质粒的纳入。

虽然在这里，我们只选择了蛋白质聚集抑制剂，但原则上，我们的平台可用于选择任何可以与遗传选择相关的环肽活性。PACE 选择已针对广泛的生物学重要活性（例如蛋白质-蛋白质相互作用）开发、蛋白质-DNA 相互作和三元复合物的形成，这些选择可以适用于环肽发现。我们的系统也可能能够容纳其他类型的遗传编码肽库。因此，我们预计我们的工作将为环肽发现提供一种多功能且可访问的新选择。

 文章来源：

Linwei Yang, Jingwei Zhang, James S Andon, Lingjun Li, Tina Wang.Rapid discovery of cyclic peptide protein aggregation inhibitors by continuous selection.Nat Chem Biol. 2025 Jan 13.

doi: 10.1038/s41589-024-01823-x. Online ahead of print.

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