杜鹃素（Farrerol）是杜鹃花（Rhododendron dauricum L.）的一种生物活性成分，作为天然黄烷酮，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、神经保护和肝保护等多种作用。毛志勇和高绍荣教授合作课题组在前期研究中（eLife，2020）发现：小分子化合物杜鹃素能够促进损伤位点处RAD51的招募，并有效促进同源重组（HR）修复效率。但这项研究中并未找到杜鹃素直接影响RAD51招募和促进HR修复的蛋白靶点及其潜在的具体分子机制。

2023年4月3日，同济大学蒋颖、高绍荣、毛志勇与中国药科大学徐晓军教授团队发现去泛素化酶UCHL3是杜鹃素的直接靶点，机制上，杜鹃素与UCHL3直接结合并激活其去泛素化酶活，促进 RAD51 去泛素化，从而改善同源重组修复。

01  UCHL3作为杜鹃素的潜在靶标

为了解析杜鹃素对HR修复的调节机制，研究通过LiP-SMap技术确定杜鹃素的直接靶向的特定蛋白质（图1A）。发现101种不同的肽可能与杜鹃素相关，对照组和杜鹃素处理组之间的进一步比较表明，10种蛋白质发生了显著变化，其中，2种蛋白DNA-PKcs (PRKDC)和UCHL3被报道参与DNA修复的调节（图1B）。通过CETSA测定发现UCHL3，而不是DNA-PKcs，可能是杜鹃素的靶点（图1C）。进一步通过SPR发现杜鹃素UCHL3之间存在强烈的相互作用，解离常数（Kd）达到36.73nM（图1D）。共结晶实验发现杜鹃素的酚羟基与UCHL3中的两个氨基酸残基Lys187和Arg215形成氢键（图1E）。随后创建了两个UCHL3突变体，UCHL3–K187A 和UCHL3–R215A，CETSA和SPR发现突变两个氨基酸位点会消除杜鹃素与UCHL3的结合（图1F）。结果表明杜鹃素通过通过两个氨基酸残基Lys187和Arg215与UCHL3结合。

                                            图1 UCHL3作为杜鹃素的潜在靶标

02  杜鹃素通过UCHL3发挥作用

进一步机制研究发现，UCHL3缺失可消除杜鹃素对HCA2-H15c细胞中HR的修复作用（图2A），在小鼠胚胎干细胞中发现杜鹃素介导的HR修复增强在很大程度上依赖于UCHL3（图2B）。在HCA2-hTERT细胞中，杜鹃素促进RAD51在DNA损伤位点的募集，而UCHL3突变（R215A/K187A）表达的UCHL3-KO细胞中，杜鹃素不能促进RAD51募集（图2C）。酶活实验发现杜鹃素激活UCHL3的去泛素化酶活（图2D），体外去泛素化实验发现杜鹃素促进UCHL3介导的RAD51去泛素化，而敲除UCHL3则消除了杜鹃素对RAD51去泛素化作用（图2E），表明杜鹃素通过靶向UCHL3，直接激活UCHL3的去泛素化酶活，降低RAD51的泛素化水平，增强HR修复。

                                                           图2 杜鹃素通过UCHL3发挥作用

总结与讨论

天然产物是药物发现的宝贵资源，挖掘他们在不同疾病种的疗效并阐明其作用靶点和作用机制对扩大其临床适应症至关重要。该研究基于前期的结果发现，小分子化合物杜鹃素能够促进损伤位点处RAD51的招募，并有效促进同源重组修复效率，但该研究中并未找到杜鹃素直接影响RAD51招募和促进HR修复的蛋白靶点及其潜在的具体分子机制。在这篇文章中，研究进一步找到了杜鹃素的直接作用靶点，并通过多种手段进行了验证，最后发现了杜鹃通过直接作用靶点发挥作用的相关机制。

文章来源：Zhang W , Wang M , Song Z ,et al.Farrerol directly activates the deubiqutinase UCHL3 to promote DNA repair and reprogramming when mediated by somatic cell nuclear transfer[J].Nature Communications, 2023, 14.DOI:10.1038/s41467-023-37576-9.