巨噬细胞在炎症调节过程中起着关键作用，现已成为当下研究中探索新型抗炎策略的关注焦点。既往研究发现，部分内源性代谢物能够作为一种信号传导方式，启动巨噬细胞对于某些理化性质改变（特别是pH波动）的响应，并且与调控炎症反应等具有潜在关联。然而，在目前的研究中，对代谢物在巨噬细胞中响应环境信号时所启动的信号传导通路以及发挥的功能尚未明确。 

    该研究首次揭示了L-苹果酸独立于其自身酸度的抗炎作用，利用20K人类蛋白组芯片发现了L-苹果酸靶点蛋白BiP的直接互作蛋白IRF2BP2，随后证实了BiP-IRF2BP2信号是苹果酸的抗炎靶通路，同时首次定义了在生物大分子相互作用中扮演“氢离子传感器”角色的多羧酸小分子群。

01 L-苹果酸的抗炎作用

研究人员首先利用细胞模型等体外实验筛选出了具有显著抗炎潜力的三羧酸循环中间体L-苹果酸（MA），同时通过进一步的实验证实了L-苹果酸的抗炎作用。RNA-seq分析表明L-苹果酸的抗炎作用可能与其抑制巨噬细胞的活化有关。随后，研究者利用不同的炎症动物模型测试了L-苹果酸在体内的抗炎作用，结果显示L-苹果酸能够减弱体内的炎症反应。以上结果首次揭示了苹果酸独立于其自身酸度的抗炎作用（图1）。

图1  L-苹果酸的抗炎作用

02 L-苹果酸直接结合BiP发挥抗炎作用

接下来，研究人员探索了L-苹果酸抗炎的作用机制，利用DARTS+MS技术鉴定L-苹果酸的靶点蛋白是热休克蛋白70家族成员BiP（也称为HSPA5或GRP78），SPR、DARTS+WB等实验结果证实了L-苹果酸和BiP之间的直接相互作用。并利用体内体外实验相结合实验证明了，在BiP缺失的细胞和动物模型中，L-苹果酸的抗炎作用减弱。这些研究结果表明L-苹果酸可以通过结合BiP发挥抗炎作用（图2）。

图2  L-苹果酸直接结合BiP发挥抗炎作用

03 L-苹果酸-BiP轴靶向IRF2BP2调节炎症反应

为了阐明L-苹果酸-BiP轴与炎症调节间的具体机制，研究人员利用20K人类蛋白组芯片探究了L-苹果酸是否通过影响BiP下游互作的靶点蛋白发挥功能，进而调节炎症反应。研究团队规划了生物素对照、BiP蛋白实验组、L-苹果酸+BiP蛋白实验组三个组别的实验设计进行了靶点筛选。20K芯片筛选出的直接靶点结果结合前期的RNA-seq通路富集结果，锁定了在“糖皮质激素受体信号传导通路”和“PD-1/PDL 1癌症免疫治疗通路”中都发挥作用的 IRF2BP2蛋白作为后续的研究对象。同时，结果显示L-苹果酸可以显著抑制IRF2BP2与BiP的相互作用，IRF2BP2可能在L-苹果酸-BiP轴调节炎症过程中发挥重要作用（图3A-E）。随后，研究人员通过SPR技术验证了BiP和IRF2BP2之间的直接相互作用关系（图3F），同时发现L-苹果酸能够破坏BiP与IRF2BP2的结合（图3G），且L-苹果酸与IRF2BP2间不存在相互作用关系（图3H）。最后，研究团队利用功能性实验证实了L-苹果酸以依赖于BiP的方式减缓IRF2BP2的降解，从而调节炎症反应。

图3  L-苹果酸-BiP轴靶向IRF2BP2调节炎症反应

04 pH降低可以促进L-苹果酸以羧基依赖性方式结合BiP并抑制BiP与IRF2BP2相互作用，发挥抗炎作用

最后，研究人员发现，在巨噬细胞中pH降低可以促进L-苹果酸的羧基质子化，有利于L-苹果酸及羧酸盐类似物与BiP结合，同时以羧基依赖的方式抑制BiP-IRF2BP2间的相互作用，减缓了BiP导致的IRF2BP2蛋白发生降解反应，从而抑制促炎性巨噬细胞中IL-1β的分泌，最终发挥抗炎作用（图4）。

图4  pH降低促进L-苹果酸结合BiP并抑制BiP-IRF2BP2相互作用，发挥抗炎作用

总结与讨论

本研究首次揭示了L-苹果酸独立于其自身酸度的抗炎作用，并利用20K人类蛋白组芯片筛选发现了L-苹果酸可以减弱其靶点蛋白BiP和IRF2BP2的直接互作，随后证实了BiP-IRF2BP2信号是苹果酸的抗炎靶通路，同时揭示了一种此前未被认识的质子/羧酸盐双感应通路，即pH水平和L-苹果酸共同调节炎症反应，为治疗炎症性疾病提供了潜在治疗手段与作用靶点。该发现首次定义了在生物大分子相互作用中扮演“氢离子传感器”角色的多羧酸小分子群。

文章来源：Chen YJ, Shi RC, Xiang YC, Fan L, Tang H, He G, Zhou M, Feng XZ, Tan JD, Huang P, Ye X, Zhao K, Fu WY, Li LL, Bian XT, Chen H, Wang F, Wang T, Zhang CK, Zhou BH, Chen W, Liang TT, Lv JT, Kang X, Shi YX, Kim E, Qin YH, Hettinghouse A, Wang KD, Zhao XL, Yang MY, Tang YZ, Piao HL, Guo L, Liu CJ, Miao HM, Tang KL. Malate initiates a proton-sensing pathway essential for pH regulation of inflammation. Signal Transduct Target Ther. 2024 Dec 30;9(1):367. doi: 10.1038/s41392-024-02076-9. PMID: 39737965; PMCID: PMC11683149.

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