一、研究背景

急性肺损伤ALI是一种以急性低氧性呼吸窘迫和非心源性肺水肿为特征的严重临床疾病，ALI具有发病率高、死亡率高的特点，除机械通气维持治疗外，目前尚无有效的药物。线粒体应激后产生的线粒体DNA（mtDNA）通过线粒体内膜上的线粒体通透性转换孔（mPTP）和外膜上的VDAC孔依次释放到细胞质中，在线粒体活性氧诱导下，胞浆氧化型mtDNA（Ox-mtDNA）可与NLRP 3结合，激活NLRP 3炎性体，增加裂解型caspase-1（半胱天冬酶 - 1）的表达，从而促进IL-1β和IL-18的成熟。在病理状态下，病原体相关分子模式（PAMP）、损伤相关分子模式（DAMP）和活性氧（ROS）可促进巨噬细胞线粒体膜mPTP开放和VDAC寡聚化，并促进线粒体DNA或Ox-mtDNA进入胞浆。 

二、研究内容

2.1 Balasubramide 衍生物的发现与筛选

图1.在巨噬细胞中具有强抗炎作用的巴拉舒溴胺衍生物（+）3C-20的发现

作者对从黄皮叶中提取的天然产物（+）-Balasubramide（（+）3 J）巴拉舒布胺（图1A）进行结构修饰合成了一系列化合物，通过活性筛选发现（+）3C-20不仅剂量依赖性地抑制LPS诱导的TNF-α细胞因子在上清液中的释放，而且显著地抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞（图1B）和小鼠原代骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）（图1C）中促炎介质表达（TNF-α）的升高。同时（+）3C-20还可以减少与LPS处理 预孵育或共孵育的BMDM中TNF-α的释放（图1D）。作者证实（+）3C-20降低了用LPS刺激的RAW 264.7和THP-1细胞中促炎介质（TNF-α、Il-1β、Il-6、Ptgs-2）的转录水平，这与BMDM和外周血单核细胞（PBMC）中的结果一致（图1 E、F;）作者通过通过形态学变化和LDH释放作为指标评价（+）3C-20显著降低了NLRP 3炎性体激活剂刺激的细胞死亡的幅度（图1G-I）。

2.2（+）3C-20减轻脓毒症所致急性肺损伤小鼠的肺部炎症

图2.（+）3C-20减轻脓毒症所致急性肺损伤的炎症反应。

为了确定（+）3C-20是否以剂量依赖性方式减轻脓毒症诱导的急性肺损伤，作者建立了小鼠脓毒症并发ALI模型，实验工作流程如图2A所示。作者发现（+）3C-20不仅显著逆转LPS诱导后小鼠肺器官系数的上调（图2B）。同时，（+）3C-20剂量依赖性地降低血清中TNF-α的分泌，并降低肺组织中炎性细胞因子（TNFα、IL-1β、IL-6、Inos）的转录水平，特别是在50 mg kg−1剂量下（图2C、D）。作者进一步发现用10或50 mg kg−1的（+）3C-20预处理的组显示出较少的组织病理学损伤（图2 E、F）。

2.3（+）3C-20减轻LPS致小鼠急性肺损伤时巨噬细胞的炎症反应

图3.（+）3C-20能明显改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤。

作者想进一步验证（+）3C-20对直接肺损伤的治疗作用。于是在小鼠中建立了通过气管输注LPS诱导的ALI模型，以评估（+）3C-20的抗炎作用（图3A）。肺器官系数数据显示，给予50 mg kg-1的（+）3C-20可以抑制肺指数的上调（图3B），以及显著抑制肺组织中LPS诱导的TNF-α蛋白的分泌（图3C）。同时降低了促炎因子（Tnf-β、IL-1β、IL-6、Inos、Ptgs 2）的基因表达，并上调了抗炎因子（Cd 206、Arg-1）的转录水平（图3D;图S5 A、B）。H&E实验结果表明，（+）3C-20以剂量依赖性方式显著减轻肺泡壁厚度、出血、炎性细胞浸润和肺泡结构丧失，给予50 mg kg−1的（+）3C 20显示出更好的治疗效果（图3E，F）。LPS处理后30 min给予50 mg kg−1（+）3C-20，结果显示，造模后给予（+）3C-20也可以减少炎性因子的转录和释放，减轻LPS诱导的急性肺损伤引起的肺组织损伤水肿和损伤。此外，也提高了小鼠的存活率（图3G）降低了肺湿/干重比（图3 H）。作者研究了（+）3C-20对炎性细胞募集到肺室的影响，观察到包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞在内的炎性细胞的数量在给予LPS后迅速增加，其通过用（+）3C-20预处理而显著降低（图3 K-M）。

2.4 化学蛋白质组学揭示了（+）3C-20的潜在靶点

图4.通过基于活性的蛋白质谱（ABPP）进行的（+）3C-20的靶标鉴定

作者基于（+）3C-20结构设计并合成了光亲和探针（+）3C-20-probe，以寻找其抗炎作用的可能蛋白靶点。（图4A），作者首先在RAW264.7细胞中原位测试了（+）3C-20-探针结合蛋白的标记效率。经SDS-PAGE分离和凝胶荧光成像扫描后，（+）3C-20-探针通过与TAMRA-PEG 3-N3的点击化学反应标记了许多与NP相比差异的蛋白条带。（图4B）。作者用（+）3C-20-探针与生物素EG 3-N3之间的点击反应标记潜在的靶蛋白，并用链霉亲和素磁珠富集蛋白。将从珠上洗脱的蛋白分离并通过SDS-PAGE转移，并且（+）3C-20-探针组中的链霉亲和素-HRP标记条带与荧光扫描的结果一致（图4C）。银染色后，将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质被蛋白酶水解成肽，并通过LCMS/MS分析特异性蛋白质信息（图4D）。根据质谱分析结果，排除NP的影响，从RAW264.7原位和裂解液水平获得了55个肽匹配得分高的蛋白质。基于之前银染色条带的位置差异，原位验证了RAW 264.7中的前五个靶标，发现只有VDAC 1可以被（+）3C-20-探针特异性拉下（图S7 B）。

2.5 VDAC 1是巨噬细胞中（+）3C-20的直接结合靶点

                            图5.（+）3C-20与巨噬细胞中的VDAC 1结合并共定位

图S7 VDAC 1是（+）3C-20的活性靶标

作者为了验证VDAC 1是否是（+）3C-20的直接结合靶点，进行了体外原位竞争实验（图5A，B）体外高浓度和原位相同浓度的（+）3C-20可竞争性抑制（+）3C-20-探针与VDAC 1的结合。同时为了消除细胞内其他蛋白质的干扰，作者使用纯化蛋白水平的重组人VDAC 1蛋白（rhVDAC 1）研究了（+）3C-20和VDAC 1之间的结合关系，孵育后发现生物素-（+）3C-20能够拉低rhVDAC 1，而DMSO和（+）3C-20不能，高浓度的（+）3C-20可竞争性抑制生物素-（+）3C-20与rhVDAC 1的结合（图5C）；此外，在蛋白质水平上未发现生物素-（+）3C-20和rhVDAC 2之间的相互作用（图5D）。作者通过细胞热位移实验（CETSA，图5E）和SPR（表面等离子体共振，图5G）实验证明了VDAC 1蛋白是（+）3C-20的结合靶点。作者进行了生物素-（+）3C-20与VDAC 1以及线粒体共定位实验（图5 H），并且使用siRNA敲低RAW264.7细胞中的VDAC 1表达，发现VDAC 1表达的下调有效降低了巨噬细胞中的炎症反应（图5I;图S7 G，H）。

2.6（+）3C-20通过减少VDAC 1寡聚化抑制mtDNA释放和NLRP 3炎症体激活

图6.（+）3C-20阻断VDAC 1寡聚化并抑制胞质mtDNA释放和NLRP 3炎性体激活

为了研究（+）3C-20对NLRP 3炎性体的作用，作者用LPS和ATP诱导小鼠BMDM细胞中NLRP 3炎性体的活化。胞质游离mtDNA的量反映了线粒体VDAC 1膜孔开口的大小。BMDM中的LPS刺激引起mtDNA指数的快速增加，然而，（+）3C-20显著抑制了BMDM中LPS引起的胞质mtDNA增加（图6 B）。免疫荧光染色数据显示，（+）3C-20还可以在NLRP 3活化条件下显著抑制巨噬细胞中Ox-mtDNA的生成（图6C）。mtDNA依赖于线粒体膜孔通道进入细胞质，并且线粒体外膜中的VDAC寡聚化是通道开放的必要构象条件。免疫印迹试验结果显示，LPS刺激的BMDM中VDAC 1的寡聚化显著增加，而（+）3C-20可以剂量依赖性方式抑制VDAC 1寡聚化（图6D;图S8 B）。作者不仅在BMDM中观察到类似的结果，而且在RAW264.7和iBMDM细胞中也观察到类似的结果（图S8 C-F，）。随后为了确定（+）3C-20与VDAC 1之间的结合方式和氨基酸位点，作者进行了分子对接，结果表明，（+）3C-20与VDAC 1的N-末端残基形成多重相互作用，包括氧原子与Gly 甘氨酸021、Tyr 酪氨酸022和Lys 赖氨酸028之间的氢键，以及八元内酰胺环与Lys 028之间的阳离子-β-堆叠（图6 E）。作者在VDAC 1中进行了单点突变，并在HEK 293 T细胞中测量了它们对（+）3C-20的反应（图S8 I，J）。蛋白质印迹结果显示，与（+）3C-20的作用类似，VDAC 1 Y 022 A和K 028 A突变体似乎显著逆转野生型（WT）VDAC 1的寡聚化，而G 021 A突变体对寡聚化具有可忽略的作用（图6 F，G）。

图S8（+）3C-20抑制巨噬细胞中VDAC 1的寡聚化

2.7（+）3C-20通过抑制VDAC 1和限制NLRP 3炎症因子的活化来改善体内急性肺损伤

图7.（+）3C-20靶向VDAC 1抑制NLRP 3炎性体的活化及改善LPS诱导的小鼠ALI

作者在小鼠中进行VDAC 1敲低巨噬细胞的消耗和重建实验，实验表明，与用正常对照巨噬细胞重建的野生型小鼠相比，去除自身巨噬细胞并重建VDAC 1敲除的野生型小鼠对气管滴注LPS诱导的急性肺损伤具有保护作用，表明VDAC 1缺陷可改善急性肺损伤的症状，如肺组织学损伤，炎性细胞浸润和肺指数降低，血清和肺组织中促炎细胞因子表达降低（图7 B-J）。作者还发现VDAC 1缺乏可减少ALI小鼠肺中NLPR 3炎性体的活化，具有与（+）3C-20施用或（+）3C-20和敲低-VDAC 1的同时施用相同的效果（图7 K，L）。

2.8（+）3C-20预防ALI患者PBMC中胞浆mtDNA释放和炎症

图8.（+）3C-20抑制ALI患者外周血单个核细胞线粒体DNA释放和炎症反应

为了证明在上述体外和体内实验中观察到的炎症和VDAC 1寡聚化之间的相关性，作者进一步分离了急性肺损伤患者的外周血单核细胞（PBMC），并建立了LPS诱导的炎症模型。在LPS刺激后，PBMC细胞质中的mtDNA显著增加，而（+）3C-20处理显著减少胞质mtDNA释放，这与上述体外发现一致（图8A）。（+）3C-20处理还抑制了LPS刺激的PBMC中TNF-α蛋白的上调和促炎因子的转录水平（图8B-F）。健康个体或ALI患者PBMC和全血中VDAC 1的转录水平保持不变，但（+）3C-20可以下调PBMC中VDAC 1的转录水平（图8 G），蛋白质印迹结果表明，PBMC中VDAC 1的蛋白质表达在有或没有（+）3C-20处理的情况下不受影响，这也表明（+）3C-20是通过减少VDAC 1的寡聚化而不是抑制其表达来发挥抗炎作用（图S11 C）胞浆mtDNA在LPS刺激下主要通过线粒体外膜上的VDAC 1寡聚化孔进入胞浆，因此可以通过胞浆mtDNA的表达水平来定量VDAC 1寡聚化的状态。

三、总结

本研究通过结构改造获得 Balasubramide 衍生物（+）3C - 20，体内外实验证实其可改善急性肺损伤，通过 ABPP 技术确定 VDAC 1 为靶点，揭示其抑制 VDAC 1 寡聚化发挥抗炎作用的机制，为急性肺损伤治疗提供了新方向和潜在药物。

文章来源：Song JQ, Shen LJ, Wang HJ, Liu QB, Ye LB, Liu K, Shi L, Cai B, Lin HS, Pang T. Discovery of Balasubramide Derivative with Tissue-Specific Anti-Inflammatory Activity Against Acute Lung Injury by Targeting VDAC1. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec;11(48):e2410550. doi: 10.1002/advs.202410550. Epub 2024 Nov 18. PMID: 39556713; PMCID: PMC11672292.

免责声明：本文转自第三方平台，版权归原作者所有，仅供信息传播与参考，不代表本平台的观点和立场。如有异议请及时联系我们删除处理，联系邮箱lighter@medical-lighter.com