大脑神经环路的活动依赖于神经元动作电位的产生和传播。轴突起始段（AIS）是一个位于轴突上靠近胞体的结构，是神经元动作电位起始的地方，对于神经元极性的建立和维持至关重要，与很多神经系统疾病也密切相关。目前对于AIS组分的了解有限，这阻碍了在生理和病理情况下对AIS结构和功能调控的理解。

现有研究方法具有局限性，常用的免疫荧光染色通量较低；AIS区域结构致密可溶性差，IP分离其中的蛋白质组分效果不佳；基于生物素连接酶BioID/ TurboID或过氧化物酶APEX/HRP的邻近标记方法需要将融合了诱饵蛋白的邻近标记酶通过转染或病毒侵染等手段导入到细胞，可能会导致诱饵蛋白的错误定位。例如，BioID技术被用于鉴定体外培养海马体神经元AIS蛋白质组分，由于诱饵蛋白出现了在AIS以外的错误定位，所获得数据的空间特异性较低。

2023年12月11日，北京大学化学与分子工程学院、IDG麦戈文脑科学研究所、北大-清华生命科学联合中心邹鹏课题组，与贝勒医学院Matthew N. Rasband课题组合作，在《Nature Communications》发表了题为“Immunoproximity biotinylation reveals the axon initial segment proteome”的论文。本研究发展了基于免疫邻近化学标记的新技术，助力了AIS蛋白质组分的深度鉴定。

主要结果：

使用针对特异性定位于AIS蛋白质组分的NF186的一抗孵育固定的神经元，再将偶联过氧化物酶HRP的二抗靶向至AIS处。接下来利用HRP在过氧化氢的触发下催化生物素苯酚，产生生物素苯酚自由基，以100 nm的扩散半径对NF186邻近的蛋白质分子进行生物素化共价标记。再利用链霉亲和素与生物素的高度亲和力，富集生物素化的蛋白，再通过LC-MS/MS和免疫印迹进行检测，实现对AIS组分的有效覆盖（图1a）。免疫荧光成像和免疫印迹分析均证明了IPL方法具有高空间分辨能力（图1b-c）。通过IPL方法筛选出的AIS蛋白与已报道的AIS蛋白吻合度较高，证明了使用IPL方法富集AIS组分的可行性(图1d-e)。 

随后，作者以多个神经元亚细胞结构（包括细胞体、树突、轴突等）作为空间参照，通过10重TMT标签进行定量蛋白质组学实验（图2a-b）。扣除背景信号和参照信号后，获得了高质量AIS蛋白组数据（图2c）。数据分析表明，重复实验的重复性较好（图2d），且捕获到的1403个蛋白质几乎涵盖了所有已报到的AIS分子。其中，目前已知的AIS高表达分子AnkG、TRIM46、NFASC、Nav1.2和βIV-spectrin处在数据列表前5的位置（图2e-f）。至此，作者获得了成熟神经元DIV14的AIS高覆盖度的蛋白质数据列表。 

接下来，为了探讨了AIS发育过程中其组分的动态变化，作者选取了AIS发育初期DIV7、成熟期DIV14和完全成熟期DIV21三个时间点，通过IPL策略对AIS蛋白组进行表征。通过两个TMT10标定量蛋白质组学实验（图3a），作者揭示了AIS组分的动态变化：绝大多数蛋白质随着AIS的发育表达量增加，如AnkG和Nav1.2；而少数蛋白质如TRIM46随着发育过程显著性降低（图3h-k）。至此，作者获得了神经元发育过程中与AIS生理功能匹配的蛋白质组分动态图谱。

最后，作者以DIV14的蛋白质组学数据作为指导，对排名前三且在AIS中没有任何研究的蛋白质进行了表征（图4a）。通过CRISPR/Cas9依赖的HiUGE基因敲入策略对感兴趣蛋白质添加内源性标签。成像结果显示，这三个蛋白质在AIS处有着不同程度的表达，其中支架蛋白SCRIB在AIS处呈现高度的极化（图4b和c）。随后作者通过体内外基因标签敲入策略和抗体标记实验进一步证实了SCRIB在AIS的极化分布。通过CRISPR/Cas9依赖的基因敲除策略和免疫共沉淀实验，揭示了SCRIB在AIS的富集受AIS核心组分AnkG的征募，且SCRIB的N-端结构域参与了与AnkG的互作。

总结：本研究发展了基于免疫邻近化学标记的新技术，提供了高空间特异性的神经元AIS蛋白质组数据，并描绘了在神经元发育过程中AIS蛋白质组分的动态变化。该工作鉴定到了新的AIS组分如SCRIB，并利用超分辨荧光成像、生物化学等手段对其定位和蛋白质-蛋白质相互作用进行了详细的表征。本研究为阐明AIS结构和功能的调控机制提供了丰富的数据资源。

文章来源：Zhang W, Fu Y, Peng L, Ogawa Y, Ding X, Rasband A, Zhou X, Shelly M, Rasband MN, Zou P. Immunoproximity biotinylation reveals the axon initial segment proteome. Nat Commun. 2023 Dec 11;14(1):8201. doi: 10.1038/s41467-023-44015-2. PMID: 38081810; PMCID: PMC10713531.

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