前言

急性缺血性中风是一种致死致残率高且具有破坏性的急性脑血管疾病，目前尚无有效的治疗手段，所以迫切需要确定缺血性卒中的潜在治疗靶点和干预措施。神经炎症在缺血性损伤中起着重要作用，氧化线粒体 DNA (Ox-mtDNA) 可以促进缺血性损伤。胞苷/尿苷单磷酸激酶2 (CMPK2)是一种限速酶，用于三磷酸脱氧核苷的合成，以调节mtDNA的复制，但其在神经炎症和缺血性损伤中的作用仍不清楚，并且目前尚未明确楚CMPK2是否通过调控Ox-mtDNA的产生促进缺血性脑卒中。

研究思路

首先检测人类和小鼠中风后单核细胞/巨噬细胞和小胶质细胞中的CMPK2基因表达变化。然后使用Cre重组依赖性腺相关病毒敲低小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2后对小鼠大脑中的炎症反应以及神经功能的影响。最后检测了特异性CMPK2抑制剂的天然产物去甲二氢木创酸(NDGA)对小鼠的神经炎症和缺血性损伤的改善作用。

实验内容及结果

1. 首先，作者评估了CMPK2基因在外周全血中的表达，发现缺血性卒中患者的CMPK2基因表达高度升高。并观察到CMPK2基因表达与梗死体积或NIHSS评分呈正相关，表明CMPK2可能与患者脑卒中严重程度呈正相关。然后，作者检测了8-OHdG的表达，8-OHdG是Ox-mtDNA的生物标志物，由CMPK2上调促进，免疫荧光分析显示，卒中发作后外周全血8-OHdG和CMPK2表达增加。这些发现表明，外周血CMPK2水平升高与中风患者中风严重程度呈正相关。

2. 作者建立了大脑中动脉短暂性闭塞模型（tMCAO），发现脑梗死周围区CMPK2蛋白表达24小时达到峰值。随后，免疫荧光染色结果及磁珠分选检测结果显示，卒中发作后，CMPK2在小胶质细胞/巨噬细胞中的表达明显增加，然后，在体外建立氧糖剥夺(OGD)诱导的细胞死亡模型，模拟体内脑缺血。与体内实验结果一致，CMPK2的表达呈时间依赖性显著升高，并在小鼠原代小胶质细胞中于6 h达到峰值。总的来说，这些数据表明CMPK2主要在缺血急性期脑的小胶质细胞/巨噬细胞中的表达增加。

3.然后，作者在右皮层微注射小胶质细胞/巨噬细胞特异性腺相关病毒沉默CMPK2，随后采用免疫荧光和免疫印迹检测了mCherry标记的AAV的转染效率，接下来评估了局部脑血流量(rCBF)以排除脑血管变异的可能性，TTC染色显示CMPK2沉默后可明显改善的缺血体积以及改善短期神经预后。基于上述结果发现小胶质细胞/巨噬细胞特异性CMPK2沉默可改善小鼠tMCAO模型的缺血性损伤。

4.接下来进一步研究CMPK2对缺血发作后长期功能结果的影响，缺血CMPK2沉默小鼠显著提高了神经功能和相对延迟期(28天)的存活比例。这些结果表明，小胶质细胞/巨噬细胞中的CMPK2至少在一定程度上导致了缺血性脑卒中后的缺血性损伤和长期功能表现不佳。

5.为了寻找小胶质细胞保护缺血性卒中的潜在机制，作者评估了小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2沉默对小胶质细胞形态的影响。结果显示CMPK2敲低抑制了小胶质细胞的过度激活。8-OHdG是Ox-mtDNA的生物标志物。检测结果显示CMPK2介导的Ox-mtDNA可驱动NLRP3炎症部分活化，最终促进邻近细胞的炎症和死亡。

6.基于上述发现，作者提出CMPK2抑制剂可能作为缺血性卒中的有希望的药物治疗方法。天然化合物NDGA是一种有效的CMPK2抑制剂，实验证明NDGA可以减轻脑损伤，并在对tMCAO进行治疗后呈现更好的长期神经预后。此外，小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2敲低或NDGA处理抑制新合成mtDNA的表达和Ox-mtDNA的形成，从而限制NLRP3炎性体的激活。

7.最后，作者发现与载药组相比，NDGA给药剂量依赖性地改善了缺血发作后TTC染色的缺血体积，并显著降低了缺血发作后的神经学评分。

8.在病理状态下，ROSs、病原相关分子模式和损伤相关分子模式(DAMPs)可以促使线粒体膜上的线粒体通透性过渡孔(mPTP)打开和电压依赖性阴离子通道(VDAC)寡聚，从而促进mtDNA向细胞质释放。mtROS不直接诱导炎性小体激活，但mtROS氧化的mtDNA (Ox-mtDNA)可直接激活NLRP3炎性小体，诱导裂解caspase-1和成熟的白细胞介素(IL)-1β分泌。从机制上讲，CMPK2敲低限制了新合成的 mtDNA 和 Ox-mtDNA 的形成，并随后阻断小胶质细胞/巨噬细胞中NLRP3炎性体的激活。

总结

该研究检测了CMPK2在缺血性脑卒中中的功能。研究发现，在CX3CR1Cre/ERT2小鼠中，腺相关病毒(AAV)介导的小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2敲低，或被鉴定为特异性CMPK2抑制剂的天然产物去甲二氢木创酸(NDGA)，可以减轻脑损伤，并在短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)治疗后呈现更好的长期神经预后。此外，小胶质细胞/巨噬细胞CMPK2敲低或NDGA处理抑制新合成mtDNA的表达和Ox-mtDNA的形成，从而限制NLRP3炎性体的激活。该研究为CMPK2作为缺血性卒中和其他与神经炎症相关的神经系统疾病的潜在治疗靶点奠定了基础。

文章来源：Guan X, Zhu S, Song J, Liu K, Liu M, Xie L, Wang Y, Wu J, Xu X, Pang T. Microglial CMPK2 promotes neuroinflammation and brain injury after ischemic stroke. Cell Rep Med. 2024 May 21;5(5):101522. doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101522. Epub 2024 May 3. PMID: 38701781; PMCID: PMC11148565.

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