阿尔茨海默病（AD）是一种不可逆的神经退行性疾病，其病理特征主要包括Aβ斑块沉积和tau蛋白神经纤维缠结，二者引发神经炎症、氧化应激以及神经元和突触连接损失，导致患者的认知功能下降。目前的治疗策略主要针对AD的早期阶段，而针对AD晚期阶段的有效治疗手段较为匮乏，这主要是由于此时神经元和神经回路的受损是不可逆的。因此，开发有效的神经元再生疗法，对于AD的治疗至关重要。外源干细胞的移植为神经元与神经回路的修复再生带来了希望，然而这种策略面临免疫排斥的潜在风险。星形胶质细胞因分布广泛、可塑性强，是原位神经元再生的理想靶点。在本研究中，作者利用可穿过血脑屏障的工程化腺病毒载体，通过将内源性星形胶质细胞转化为功能性神经元，开发了一种全脑神经再生基因疗法。这种疗法实现了大脑皮层和海马中新神经元的再生。更为重要的是，再生的神经元可以整合到预先存在的神经网络中，改善AD小鼠的认知表现。

由于转录因子NeuroD1参与星形胶质细胞的重新编程，作者首先在5×FAD小鼠海马体中探究了NeuroD1介导的星形胶质细胞至神经元转化（AtN）的潜力。为了在星形胶质细胞中特异性表达NeuroD1，作者采用了星形胶质细胞特异性启动子Gfap直接驱动NeuroD1的表达，并据此构建了腺病毒载体AAV9-GFAP::NeuroD1-P2A-GFP注入小鼠海马体（图1A）。免疫组织学研究显示，AAV9-GFAP::NeuroD1-P2A-GFP注入1周后星形胶质细胞开始表达NeuroD1，而对照组则缺乏NeuroD1的表达；3周和6周时，含NeuroD1的星形胶质细胞显著表达神经元标志物NeuN（图1B-G）。这表明在5×FAD小鼠海马中，NeuroD1成功介导了星形胶质细胞向神经元的转化，实现了局部神经再生。

                           图1. 5×FAD小鼠海马中NeuroD1介导的局部AtN转化

为探究NeuroD1介导AtN转化的分子机制，作者在AD小鼠接受转染3周后进行单细胞RNA测序（ScRNA-Seq）（图2A），并通过标记基因确证了AtN转化（图2B）。为了阐明AtN转化的特征，作者分离出星形胶质细胞和神经元进行了进一步基因表达分析（图2C-H）。与对照组相比，NeuroD1转染的小鼠海马中可观察到更多星形胶质细胞分化为神经元。其中成熟星形胶质细胞相关基因表达下调，而未成熟星形胶质细胞和神经元相关基因表达上调。此外，许多与神经发生、发育、突触功能、存活和线粒体能量产生相关的基因也出现表达上调，而与神经递质稳态、代谢、囊泡运输和其它在星形胶质细胞中更常见的功能相关基因表达出现下调。这些结果显示，NeuroD1显著改变了星形胶质细胞的基因转录使其更接近于神经元，表明NeuroD1在细胞命运重编程中发挥着作用。此外，AtN转化还伴随着细胞能量代谢从星形胶质细胞依赖的糖酵解代谢转向神经元的氧化磷酸化代谢（图2I-K）。这一系列结果共同揭示了NeuroD1驱动AtN转化的分子机制。

                                   图2. Sc-RNA-Seq分析揭示了AtN的分子机制

在海马体局部AtN转化成功的基础上，作者又探究了全脑组织AtN转化的可行性，以提高AD小鼠认知能力。鉴于此，作者设计了用于全脑AtN转化的载体AAV-PhP.eB-CAG::FLEx-NeuroD1-P2A-GFP（AAV-NeuroD1），并通过免疫组化手段对全脑AtN转化进行了分析（图3A）。与对照组相比，AAV-NeuroD1载体注射10天后，星形胶质细胞中可观察到强烈的NeuroD1信号（图3B），表明星形胶质细胞开始表达转换因子NeuroD1。注射60天后，表达Neuro D1的细胞呈现神经元形态并且神经元相关标志物NeuN免疫染色信号遍布大脑皮质与海马（图3C-E）。这些结果表明，星形胶质细胞中NeuroD1的表达会诱导AD小鼠大脑皮质和海马中的AtN转化。

作者进一步研究了AtN转化效率在不同脑区的差异。结果显示，AtN转化神经元主要分布于广泛分布于大脑皮层、海马和中脑区域，而嗅球、纹状体、丘脑及后脑中等其它区域未观察到明显AtN转化神经元（图3F-I）。这表明星形胶质细胞对NeuroD1介导的AtN转换表现出区域特异性。

                                     图3. 5×FAD小鼠全脑AtN转化分析

作者探究了全脑AtN转换可以在AD小鼠脑中再生神经元的数量。为此，作者通过荧光显微光学切片断层扫描（fMOST）技术（图4A-B）对小鼠全脑进行成像（图4C-F），利用星形胶质细胞与神经元的形态差异，对神经元识别、计数（图4G-J）。分析结果表明，通过AAV-NeuroD1治疗后，小鼠全脑中总计再生了超50万个新神经元。随后对新生神经元进行电生理记录，神经元能产生重复动作电位和自发突触电流（图4K-O），证明AtN转化的神经元已整合到功能性神经回路中。

                                           图4. AtN全脑成像和电生理学研究

作者通过不同的行为测试，评估了全脑AtN转化基因疗法对5×FAD小鼠认知功能的影响（图5A）。在Y迷宫实验中，NeuroD1基因治疗组雄性小鼠短期记忆显著增强，而雌性小鼠没有这种显著的效果（图5B-C）；嗅觉习惯化实验中，雌雄治疗组嗅觉记忆均得到明显改善（图5D-E）；恐惧条件反射实验表明，治疗组恐惧记忆恢复至正常水平（图5F-G）；Morris水迷宫实验中，治疗组空间学习和记忆能力显著提升（图5H-J）。这一系列实验表明，全脑AtN转化基因疗法能显著改善5×FAD小鼠的认知功能。

                            图5. 全脑AtN基因疗法对5×FAD小鼠认知能力的改善

综上所述，本研究利用能穿透血脑屏障的腺病毒载体，在AD小鼠全脑星形胶质细胞中靶向表达NeuroD1，通过其介导的AtN转化，在大脑皮层和海马体中成功再生神经元并整合入神经回路，显著改善了5×FAD小鼠的认知功能，为AD治疗提供了一种基于神经再生的基因治疗策略。

文献引用：Wu Z, Xu L, Xie Y. et al.Brain-Wide Neuroregenerative Gene Therapy Improves Cognition in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb 14:e2410080. doi: 10.1002/advs.202410080. Epub ahead of print. PMID: 39951299.

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