三维（3D）细胞培养技术革新了生命科学领域，尤其在类器官技术中表现突出。然而，传统生物支架材料因阻碍肿瘤类器官解离，限制了类器官-免疫细胞共培养系统的常规应用。本研究提出一种“声学虚拟3D支架（AV-Scaf）”方法，实现无支架3D肿瘤类器官培养，并构建直接交互的肿瘤类器官-免疫细胞共培养系统。通过涡旋声场促进肿瘤细胞自组织过程，实现细胞生物组装及离子通道激活。该方法显著增强钙离子内流，加速细胞聚集体间的相互作用。利用AV-Scaf成功构建无支架黑色素瘤与乳腺癌类器官，并与T细胞共培养。结果显示，该共培养系统显著激活T细胞，表现为颗粒酶B（GZMB，2.82%升至17.5%）与干扰素-γ（IFN-γ，1.36%升至16%）的显著上调。AV-Scaf为肿瘤类器官-免疫细胞研究提供高效工具，推动癌症研究与免疫治疗发展。

3D细胞培养技术极大推动了生命科学与组织工程发展。肿瘤类器官作为自组织3D培养物，因保留原始组织的形态、遗传与功能特征，成为重要的临床前模型。为更真实模拟肿瘤微环境（TME），研究者开发了类器官与免疫细胞等成分的共培养系统，用于化疗、靶向治疗及免疫治疗的临床前测试。其中，T细胞激活对模拟TME内免疫反应至关重要。然而，传统类器官培养方法（如基质胶、液滴或微室）虽提供3D结构支持，却阻碍肿瘤细胞与共培养细胞直接接触，限制了T细胞激活效率。

机械刺激对细胞命运决定具有关键影响。超声（US）作为一种机械波，可通过非接触方式操控细胞，为类器官技术提供了新思路。本研究开发了声学虚拟3D支架（AV-Scaf）方法，通过20 MHz超声换能器与透镜产生涡旋声场，实现肿瘤细胞的无接触聚集与机械刺激。研究发现，钙离子内流与离子通道激活是促进细胞自组织的关键机制。以黑色素瘤与乳腺癌类器官为例，AV-Scaf构建的无支架类器官与T细胞共培养时，T细胞激活效率显著高于基质胶法，为免疫治疗研究提供了更优模型。

结果

1. AV-Scaf实现无支架肿瘤类器官培养  

声学技术为3D细胞操控提供了前沿策略。通过聚焦涡旋声场（图1A），肿瘤细胞在声辐射力与声流作用下非接触聚集（图1B），形成尺寸适宜的类器官（图1C）。与传统基质胶法相比，AV-Scaf无需生物支架，避免了基质移除对类器官的机械损伤（图1D-E）。优化后的20 MHz超声换能器（图1F-H）产生高精度声场，促进细胞自组织（图1I）。

图1. AV-Scaf构建无支架肿瘤类器官示意图  

(A) AV-Scaf策略示意图。  

(B) 超声场中细胞运动与聚集示意图（左）；黑色素瘤细胞聚集前后的显微图像对比（右）。比例尺：500 μm（使用Figdraw绘制）。  

(C) AV-Scaf形成无支架类器官系统的过程示意图。比例尺：100 μm。  

(D) 超声换能器实物图与爆炸视图。比例尺：5 mm。  

(E) 换能器随频率变化的电阻抗幅值与相位曲线（左），脉冲回波波形及归一化频谱（右）。  

(F) 涡旋透镜设计参数与实物图。比例尺：5 mm。  

(G) 不同z轴平面上xy平面的模拟声场振幅（上）与相位（下）。  

(H) 声场三维模拟形态与水平方向声辐射力分布。  

(I) 焦平面xy平面的声强（左）与相位（右）模拟俯视图。

实验参数优化显示，100 mV电压与2分钟处理时间可平衡细胞活力与类器官形成效率（图2A-D）。AV-Scaf培养的乳腺癌与黑色素瘤类器官形态与基质胶法相似（图2E-G），且保留组织特异性标记物（图2H-J）。RNA测序分析表明，超声刺激显著上调钙信号通路与细胞黏附相关基因（图3A-H），促进ECM生成（图4E-F）。钙通道阻断实验证实，钙离子内流是类器官自组织的关键机制（图4I-K）。

图2. 基于AV-Scaf的乳腺癌与黑色素瘤类器官构建

(A) AV-Scaf培养平台设计。  

(B) 不同电压处理2分钟后培养5天的类器官明场图像。比例尺：100 μm。  

(C) 不同电压与处理时间下类器官细胞活力。数据以均值±标准差表示（n=3）。  

(D) 100 mV电压处理2分钟的类器官直径。数据以均值±标准差表示（n=3）。  

(E-F) AV-Scaf生成的乳腺癌（E）与黑色素瘤（F）类器官时序生长图像。比例尺：100 μm。  

(G) AV-Scaf与基质胶法生成的乳腺癌（上）及黑色素瘤（下）类器官显微图像对比。比例尺：100 μm。  

(H-I) 乳腺癌类器官HER2（H）与黑色素瘤类器官Melan-A（I）免疫荧光染色。比例尺：100 μm。  

(J) AV-Scaf黑色素瘤类器官与患者原代组织的H&E及免疫组化染色对比。比例尺：100 μm。  

图3. AV-Scaf辅助肿瘤类器官与肿瘤细胞的转录组比较

(A) 差异表达基因（DEGs）统计：464个显著上调基因，186个显著下调基因。  

(B-C) 对照组与刺激组相关性热图（B）及主成分分析（C）。  

(D) 钙信号通路、组织形态发生及上皮-间质转化通路的基因集富集分析（GSEA）。  

(E-F) 基因本体（GO）富集分析显示细胞黏附、钙离子转运及信号转导等过程显著富集。  

(G-H) 钙相关（G）与黏附相关（H）基因热图，显示超声刺激的差异调控模式。  

图4. AV-Scaf类器官钙离子成像与ECM生成的共聚焦观察

(A) 超声刺激通过机械敏感离子通道增强钙离子内流机制示意图。  

(B) 钙离子通道与细胞黏附相关DEGs的韦恩图，交集区代表共调控基因。  

(C) 火山图显示钙离子通道与黏附相关基因显著上调（黄色）或下调（蓝色）。  

(D) Fluo-4染色显示对照组（左）、刺激1小时（中）与24小时（右）钙离子水平。比例尺：100 μm。  

(E-F) 乳腺癌（E）与黑色素瘤（F）类器官DAPI（蓝，细胞核）、纤连蛋白（红）及层粘连蛋白（绿）共聚焦图像，显示ECM生成。比例尺：100 μm。  

(G-H) 流式细胞术分析钙离子荧光强度随时间变化。数据以均值±标准差表示（n=3）。  

(I-K) 钙通道阻断（CCB）处理后纤连蛋白、层粘连蛋白及IV型胶原的定量分析。数据以均值±标准差表示（n=5）。  

2. 直接共培养系统显著提升T细胞激活效率  

基于AV-Scaf构建的黑色素瘤类器官与患者来源T细胞共培养（图5A）。流式分析显示，AV-Scaf组CD8+ T细胞中GZMB（17.5% vs. 2.82%）与IFN-γ（16% vs. 1.36%）表达显著高于基质胶组（图5B-E）。细胞毒性实验表明，T细胞比例升高（5:1）可显著增强类器官杀伤效果（图5F-M）。结合PD-1抗体应用，验证了该模型在免疫治疗中的潜力。

图5. AV-Scaf介导的肿瘤类器官-T细胞直接共培养系统建立与分析

(A) 共培养系统构建流程示意图。  

(B-D) CD8+ T细胞中颗粒酶B（GZMB，B）与干扰素-γ（IFN-γ，D）表达的流式图。  

(C, E) 基质胶与AV-Scaf组CD45+CD8+GZMB+（C）及CD45+CD8+IFN-γ+（E）T细胞比例。数据以均值±标准差表示（n=3）。  

(F) T细胞（比例2:1）共培养24与48小时的肿瘤类器官活/死染色。比例尺：100 μm。  

(G-H) T细胞比例2:1（G）与5:1（H）共培养的类器官活力。数据以均值±标准差表示（n=3）。  

(I) T细胞介导的AV-Scaf类器官杀伤效果明场图像。比例尺：100 μm。  

(J, L) T细胞比例2:1（J）与5:1（L）的细胞毒性随时间变化。数据以均值±标准差表示（n=5）。  

(K, M) 不同T细胞比例下类器官体积随时间缩减趋势。数据以均值±标准差表示（n=5）。

讨论  

AV-Scaf通过涡旋声场模拟虚拟3D支架，克服了传统支架材料（如基质胶）的局限性。超声刺激激活机械敏感离子通道（如PIEZO），诱导钙离子内流，驱动细胞黏附与ECM重塑，加速类器官自组织（图4A）。该无支架系统支持肿瘤与免疫细胞直接接触，显著提升T细胞激活效率，为免疫治疗研究提供了更真实的TME模型。未来，结合高通量筛选技术，AV-Scaf有望加速抗癌药物发现与个性化治疗开发。

文章来源： 

Han Shan, Maike Chen, Shuang Zhao, et al.Acoustic virtual 3D scaffold for direct-interacting tumor organoid-immune cell coculture systems.Sci Adv. 2024 Nov 22;10(47):eadr4831.

 doi: 10.1126/sciadv.adr4831. Epub 2024 Nov 22.

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