在深层组织中实现高空间分辨率的基因表达分析，一直是分子生物学和发育研究的难题。传统转录组学技术受限于光散射和穿透深度，导致信号损失，难以深入探测组织内部的基因表达模式。来自霍华德休斯医学院珍妮莉亚研究园区的科研人员提出了一种结合高分辨率亚细胞成像的先进深度组织转录组学方法，可在复杂组织环境中进行精确的空间基因表达映射。
通过整合创新成像技术和计算方法，该研究突破了传统技术的限制，实现了单细胞及亚细胞水平的基因表达分析。相关研究2025年2月20日发表在Science。

荧光显微镜中有限的颜色通道长期以来制约了生物样本的空间分析。为此，我们开发了循环杂交链式反应（cycleHCR），这一方法将多轮DNA条形码技术与HCR相结合，突破了上述限制。基于统一的条形码系统，cycleHCR实现了RNA与蛋白质的高通量同步成像。全胚胎转录组成像技术实现了在约310微米深的样本中精确的三维基因表达和细胞命运定位。当与膨胀显微镜技术联用时，cycleHCR成功解析了小鼠胚胎成纤维细胞内10种亚细胞结构组成的精密网络。在小鼠海马切片中，多靶标RNA与蛋白质成像技术揭示了复杂的基因表达梯度特征及细胞类型特异的核内结构差异。cycleHCR为深入解析组织深层空间调控机制提供了量化研究框架，不仅具有基础研究价值，也为未来诊断应用开辟了可能性。

本研究展示了如何克服光散射和信号损失等传统限制，实现深层组织中转录本的亚细胞级定位。以下是实现这一突破的关键技术：

1. 高分辨率荧光成像

· 采用荧光原位杂交（FISH）技术，实现单个细胞内 mRNA 转录本的精准定位。

· 共聚焦显微镜与光片显微镜等高级成像技术，确保在深度组织中保持高空间分辨率。

2. 克服光散射影响

· 可能使用了组织透明化技术（如 CLARITY、iDISCO）或自适应光学（adaptive optics），减少深层成像时的光学畸变。

· 计算重建可校正成像伪影，提高转录本定位的准确性。

3. 三维空间基因表达映射

· 研究沿着生物学相关轴（近远轴、前后轴、放射轴）绘制基因表达图谱。

· 生成详细的亚细胞级转录本空间分布图，揭示基因表达的空间模式。

4. 单细胞与亚细胞分辨率

· 结合单分子 FISH（smFISH）或类似的 RNA 检测技术，精确定位特定亚细胞结构中的转录本。

· 计算机图像分析区分背景噪声和真实转录本信号，确保数据可靠性。

1. 深度组织转录组学方法

· 提出了一种创新性转录组学方法，可在组织深层的嵌入细胞中进行基因表达分析。

· 关键突破在于克服了光散射和信号降解问题，这些问题长期限制了深度组织中的转录组研究。

· 该方法能够在多个空间轴上进行高分辨率转录本检测，实现详细的三维基因表达映射。

2. 高分辨率亚细胞成像

· 研究突破了空间转录组学的技术瓶颈，实现了深度组织中的亚细胞级转录本定位。

· 通过先进成像技术，研究人员成功在单细胞水平上绘制基因表达地图，揭示了此前无法检测的空间异质性。

· 荧光原位杂交（FISH）技术结合计算成像，使转录本在细胞内部的精准定位成为可能。

3. 三维基因表达几何映射

· 研究沿着生物学相关轴绘制了基因表达地图：

o 近远轴（Proximal-Distal Axis）：沿组织中轴线的距离变化。

o 前后轴（Anterior-Posterior Axis）：细胞相对于中轴线的角度变化。

o 放射轴（Radial Axis）：细胞到中轴线的径向距离。

· UMAP 聚类揭示了基因表达沿这些轴的梯度分布，为空间基因调控机制提供了新见解。

4. 基因共表达及簇分析

· 研究人员基于单细胞转录组数据进行聚类，识别出深层组织中的不同转录状态。

· 基因共表达分析表明，某些基因簇在特定梯度上表现出相似表达模式，但在关联性上存在显著差异。

· 该分析提供了对复杂组织环境中基因表达空间协调机制的更深入理解。

技术细节

1. 成像技术

· 先进荧光成像：克服光散射，提高检测深度。

· 高分辨率原位杂交（FISH）：实现亚细胞级的转录本定位。

· 共聚焦显微镜 & 光片显微镜（Light-Sheet Microscopy）：获取高分辨率三维深度组织成像。

2. 计算方法

· UMAP 聚类：识别基因表达模式的空间分布。

· 三维坐标空间变换：将基因表达数据映射到生物学相关轴。

· 单细胞转录组分析：解析细胞层级的基因调控网络。

· 相比传统转录组学，该研究在深度组织分析和高空间分辨率成像方面实现了重大突破。

· 研究发现了此前未知的空间基因表达模式，对细胞分化和组织结构的理解提供了全新视角。

· 成像技术与计算分析的整合，代表着空间转录组学领域的重大技术进步。

研究局限性

1. 深度限制：

尽管技术有所改进，组织不透明度仍对成像深度形成限制。

2.  计算复杂度：

高维数据处理对计算资源和分析算法提出了更高要求。

3. 组织特异性：

该方法是否适用于所有组织类型，仍需进一步验证。

4. 信号损失：

密集组织环境中，某些转录本仍可能难以检测。

• 本研究提出了一种强大的新方法，可在深度组织中以前所未有的空间分辨率分析基因表达。

• 通过整合先进的成像技术和计算分析**，研究提供了解析亚细胞水平转录组的全面框架。

•  尽管仍存在一定技术挑战，但该方法代表了深度组织分子生物学的重大进步，在发育生物学、疾病建模和空间基因组学等领域具有广泛的应用潜力。

高分辨率亚细胞成像实验方法分步总结

不同组织类型和实验条件需优化。

1. 组织制备

·采集目标组织，并使用甲醛或类似固定剂固定，以保持 RNA 的完整性。
·视需要选择组织透明化技术（如 CLARITY、iDISCO），以提高光穿透能力。

2. 转录本荧光探针标记

·采用单分子 FISH（smFISH）、杂交链式反应（HCR）、MERFISH等方法标记特定 mRNA。
·合理设计探针，确保靶向唯一转录本区域，避免非特异性杂交。

3. 高分辨率成像

·通过共聚焦或光片荧光显微镜进行成像，实现深度组织内的转录本检测。
·应用自适应光学，校正深度组织中的光学失真。

4. 3D 空间映射与图像处理

·通过计算转换，重建三维空间基因表达图谱。
·使用UMAP 聚类与共表达分析，识别空间基因表达模式。
·结合单分子分辨率技术，确保转录本亚细胞级精准定位。

5. 数据分析与解读

·采用机器学习方法，区分真实信号与背景噪声。
·定量分析转录本在不同细胞区室中的定位模式。

文章来源：

Valentina Gandin,Jun Kim,Liang-Zhong Yang,et al. Deep-tissue transcriptomics and subcellular imaging at high spatial resolution. Science.2025 Feb20:eadq2084. doi:10.1126/science.adq2084.Online ahead of print.

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